Vi presenterar en fluorescensanalys för att visa att Lucifer Yellow (LY) är en robust markör för att bestämma den skenbara paracellulära permeabiliteten hos hCMEC/D3-cellmonolayers, en in vitro-modell av den humana blod-hjärnbarriären. Vi använde denna analys för att bestämma kinetiken hos en konflytande enskiktslager formation i odlade hcmec/D3 celler.
Blod-hjärnbarriären BBB består av endotelceller som bildar en barriär mellan den systemiska cirkulationen och hjärnan för att förhindra utbyte av icke-essentiella joner och giftiga ämnen. Snäva korsningar (tj) tätar effektivt paracellulära utrymmet i enskiktslager resulterar i en intakt barriär. Denna studie beskriver en ly-baserade fluorescensanalys som kan användas för att bestämma dess skenbara permeabilitet koefficienten (Papp) och i sin tur kan användas för att bestämma kinetik av bildandet av konfluenta enskiktslager och den resulterande snäva korsningen och barriär integritet i monolayers hCMEC/D3. Vi ytterligare Visa en ytterligare nytta av denna analys för att avgöra tj funktionell integritet i transfekterade celler. Våra data från LY Papp analysen visar att hcmec/D3 celler seedade i en transwell setup effektivt begränsa ly paracellulära transport 7 dagar-post kultur. Som ett ytterligare verktyg för den presenterade analysen, visar vi också att DNA nanopartiklar transfektion inte förändrar ly paracellulär transport i hcmec/D3 monolayers.
Blod-hjärnbarriären (BBB) är den skyddande barriären begränsa tillströmningen av plasma komponenter i hjärnvävnaden och består av hjärnans endotelceller tillsammans med stödjande celler såsom pericyter. Den viktigaste rollen av BBB är att fungera som en barriär som tätar utrymmet mellan perifert blod och centralanervsystemet (CNS) för att upprätthålla hemostas av neurala mikromiljön1,2. Hjärnan kapillära endotelceller tätar effektivt paracellulära vägen via bildandet av intercellulära snäva korsningar (TJs)1. Denna skyddande barriär tillåter glukos och utvalda näringsämnen att komma in i hjärnan samtidigt som det hindrar majoriteten av joner, giftiga ämnen och droger från att passera genom denna snäva barriär. Bortsett från dess skyddande roll, den naturliga barriären funktion av BBB utgör en allvarlig utmaning i utvecklingen av läkemedel leveranssystem som riktar sig till CNS.
In vitro cellkultur modeller av BBB är användbara verktyg för att studera dess biologi och att förstå effekterna av läkemedelsbehandling på TJ barriär integritet. Vi använde den mänskliga cerebrala mikrovaskulära endotelceller cellinjer (hcmec/D3) som en in vitro-modell eftersom det är en accepterad modell av mänskliga hjärnan endotel3 och recapitulates många funktioner av den mänskliga BBB. hcmec/D3is en av de mest använda cellinjer för modellering av BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Trots dess jämförelsevis låga värden av transendothelial elektriskt motstånd (TEER), ett mått på barriär täthet, behåller denna cell linje de flesta av de morfologiska och funktionella egenskaperna hos hjärnans endotelceller, även som en monokultur i avsaknad av som är odlade glialceller6,7. Cell linjen hcmec/D3 uttrycker flera BBB-markörer, inklusive aktiva transportörer och receptorer, fram till ungefär passage 35 utan att genomgå Dedifferentiering till instabila fenotyper6,7,9 ,10,11. Den mest slående kännetecknande för hcmec/D3 cellinjer som en in vitro-BBB-modellen är dess förmåga att bilda TJS5,9,11,12. Det bör noteras att även om stamcells-härledda BBB-modeller visade högre permeabilitet i många studier jämfört med hCMEC/D3 cellinjer och de uttrycker några BBB markörer, de är ännu inte utvecklas som den vanligaste BBB-cellen modell13. Viktigare är att stamceller härrör BBB modeller återstår att kännetecknas med avseende på maximala passage nummer som gör att cellerna att upprätthålla stabila BBB fenotyper14.
Tre primära metoder används ofta för att bestämma TJ barriär integritet, inklusive mätning av TEER, mätning av skenbar permeabilitet koefficienten (Papp) av små hydrofila spår molekyler såsom sackaros, inulin, Lucifer gul, etc. och immunofärgning av kända molekylära markörer av TJs såsom Claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER är en relativt enkel och kvantitativ metod som mäter det elektriska motståndet över cell enskiktslager odlade på ett poröst membran substrat5. Men TEER värden kan påverkas av experimentella variabler såsom sammansättningen av odlingsmediet och typ av mätinstrument. En sannolik kombination av dessa faktorer leder till en bred fördelning av TEER värden som sträcker sig från 2 till 1150 Ω cm2 i hcmec/D3 cell linjen odlade för 2-21 dagar13. Immunofärgning är en visuell metod för bestämning av förekomst av TJ-proteiner genom märkning av det riktade proteinet med hjälp av antikroppar. Emellertid, immunofärgning innebär en serie experimentella steg, inklusive behovet av att fastställa/permeabilize celler som kan resultera i experimentella artefakter och fluorescerande signaler kan blekna över tiden. Ovanstående faktorer kan leda till subjektiva fel som påverkar datakvaliteten.
Det primära fokus för detta arbete är att presentera en ly-baserade skenbara permeabilitet assay bestämma kinetik av en konfluenta enskiktslager formation i odlade hcmec/D3 celler. Även om andra avancerade in vitro-BBB-system, såsom samkultursystem, mikrofluidiska system, är fysiologiskt mer relevanta mimik med signifikant förbättrad barriärfunktion15,16,17, hcmec/D3 transwell setup är en enkel och pålitlig modell för att uppskatta kinetiken av TJ formation och snabbt skärmen effekten av olika läkemedelsformuleringar på barriärfunktion. I allmänhet, Papp värden är konsekventa för olika hydrofila lösta ämnen i hcmec/D3 monolayers. Till exempel de rapporterade P app värden för olika lågmolekylärt massa lösta ämnen (såsom sackaros, mannitol, ly, etc.) i olika in vitro– BBB-modeller är i storleksordningen 10-4 cm/min5,18,19 , 20. i vår experimentella inställning, är hjärnans endotelceller seedade på ett kollagen-belagda mikroporösa membran för cell infästning och enskiktslager bildas för att efterlikna in vivo barriären. Den LY läggas i den apikala sidan förväntas passera intercellulära snäva korsningar och ackumuleras i den basolaterala sidan. Större koncentrationer av LY i basolaterala sidan indikerar en omogen, inte-fullt funktionell barriär medan lägre koncentrationer återspeglar begränsad transport på grund av närvaron av funktionella TJs resulterar i en mogen barriär.
LY är en hydrofila färgämne med distinkta excitation/emission toppar och undviker behovet av att radiomärka Tracer molekyler såsom sackaros, mannitol eller inulin. Således kan fluorescensvärdena av LY användas för att direkt beräkna dess paracellulära permeabilitet över BBB monolayers. Också, jämfört med många kommersiellt tillgängliga färgämnen som används i biomedicinska fält som lider av små Stokes SKIFT som fluorescein21, den Stokes förskjutning av ly är ca 108 nm med tillräcklig spektralseparation, vilket gör att ly fluorescensdata som en robust avläsning för att bestämma paracellulär permeabilitet. Vi använde Western blotting som en ortogonal teknik för att demonstrera förändringar i uttrycket av den snäva korsningen markör protein, ZO-1, över kultur tid. ZO-1 uttryck detekteras via Western blotting används för att komplettera ly Papp data och i kombination, dessa data tyder på att de observerade förändringarna i ly papp värden är reflekterande av bildandet av en enskiktslager med gradvis ökning av uttryck för den snäva knutpunkten, ZO-1.
Som påpekats tidigare, är det centrala fokus för detta arbete att demonstrera en ly assay som en enkel teknik för att övervaka bildandet av en konfluenta enskiktslager med funktionella snäva korsningar. Men för att demonstrera en ytterligare nytta av den utvecklade analysen, vi mätt den LY Papp i DNA nanoparticle-transfected hcmec/D3 monolayers. Nukleinsyror kan kondenseras till polyelektrolytnanopartiklar med en diameter på 100-200 nm via elektrostatisk interaktion mellan de positivt laddade grupperna av polymerer och de negativt laddade fosfat grupperna av nukleinsyror22, 23. Vi hänvisar till dessa komplex som DNA nanopartiklar (DNA NPS) i vårt arbete. Medan vår avsikt är att transfect celler och uttrycka det önskade proteinet, måste vi se till att barriär egenskaperna hos hcmec/D3 enskiktslager inte äventyras. Våra data tyder på att en standard 4 h luciferas Gene transfection regim inte mätbart ändra den ly permeabilitet visar nyttan av ly Papp analysen för att avgöra förändringar i tj barriär integritet.
En viktig roll för BBB är att förhindra utbyte av icke-väsentliga joner och giftiga ämnen mellan den systemiska cirkulationen och hjärnan för att upprätthålla hemostas av neurala mikromiljö. En av de karakteristiska dragen i BBB är förmågan hos de kapillära endotelceller att bilda snäva korsningar (TJs) som effektivt tätar paracellulär transportväg. Vi visade en LY Papp- analys som en kvantitativ metod för att bestämma den skenbara KINETIKEN av tj barriär bildning i odlade hcmec/D3 monolay…
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för det ekonomiska stödet från 2017 New Investigator Award från American Association of Pharmacy, en Hunkele fruktade Disease Award från Duquesne University och School of Pharmacy start-up medel för Manickam Laboratory. Vi vill tacka Läckagelaboratoriet (Duquesne University) för Western blotting hjälp och tillåta användning av deras Odyssey 16-bitars Imager. Vi skulle också vilja inkludera en särskild anteckning om uppskattning för Kandarp Dave (Manickam Laboratory) för hjälp med Western blotting.
hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |