Isolering af primære Murine skeletmuskulatur mikrovaskulære Endothelial Cells
Summary
Mikrovaskulære endotelceller af skeletmuskulatur (MMEC) form indersiden af muskel kapillærer og regulere både, udvekslingen af væsker/molekyler og migration af (immunceller) mellem muskelvæv og blod. Isolering af primære murine MMEC, som beskrevet her, giver mulighed for omfattende in vitro-undersøgelser af “myovascular enhed”.
Abstract
Endotelceller af skeletmuskulatur kapillærer (muskel mikrovaskulære endotelceller, MMEC) opbygge barriere mellem blodet og skeletmuskulatur regulerer udvekslingen af væsker og næringsstoffer samt immunrespons mod smitsomme agenter ved at kontrollere immun celle migration. For disse funktioner, MMEC danne en funktionel “myovascular enhed” (MVU), med yderligere celletyper, som fibroblaster, pericytes og skeletmuskulatur celler. Derfor bidrager en dysfunktion af MMEC og derfor MVU til en lang række myopatier. Men reguleringsmekanismer af MMEC i sundhed og sygdom forbliver utilstrækkeligt forstået og deres udredning forud for mere specifikke behandlinger for myopatier. Isolation og tilbundsgående undersøgelse af primær MMEC funktioner i forbindelse med MVU kunne fremme en bedre forståelse af disse processer.
Denne artikel indeholder en protokol for at isolere primære murine MMEC af skeletmuskulatur af mekanisk og enzymatiske dissociation herunder rensning og kultur vedligeholdelse skridt.
Introduction
Via blodbanen, celler og organer leveres med ilt, substrater og andre nødvendige molekyler. Denne udveksling foregår i kapillærer, de mindste fartøjer. Kapillærer er dannet af en indre endotel (EF) cellelag hvis integritet er fortsat en forudsætning for vellykket regulering af muskel homøostase mellem det intravaskulære og interstitielle rum. For at sikre en selektiv overgang af opløselige faktorer og celler, EF udgør en éncellelag forbundet af stram og adherens vejkryds 1. Ud over sin rolle som barriere for næringsstoffer eller stofskifteprodukter regulere EF ansættelse af leukocytter i inflammatoriske processer. Betændelse eller væv skader fører til en op-regulering af adhæsionsmolekyler på EF overflade og produktion af kemokiner lette leukocyt vedhæftet fil og transmigration i target væv 2. EF er derfor kritisk involveret i reguleringen af inflammatoriske processer som forsvar mod patogener eller væv reparation.
En dysfunktion i EF er direkte forbundet med Vaskulære sygdomme, kronisk nyresvigt, venøs trombose svær patogen infektioner. Derudover EF er næsten altid involveret i orgel-specifikke autoimmunitet såsom diabetes mellitus eller multipel sklerose 3. Funktionen barriere mellem blodet og organer er derfor styret af et samordnet samspil af forskellige celletyper. I skeletmuskulaturen mikrovaskulære endotelceller (MMEC) samt muskelceller, fibroblaster og pericytes udgør en funktionel enhed, “myovascular enhed” (MVU). Derfor kan en dysfunktion af MVU spiller en afgørende rolle i Patofysiologi af myopatier. Dog en dybere forståelse af disse reguleringsmekanismer stadig mangler og i øjeblikket er til hinder for identifikation af nye, presserende, terapeutiske mål i myopatier.
For at undersøge de komplicerede fysiologiske og patofysiologiske mekanismer, er dyremodeller almindeligt anvendt. Men, in vitro- modeller tilbyder fordel fokusere på emne af interesse ved at udelukke en række forstyrrende faktorer. For at undersøge processer in vitro-det er nødvendigt at isolere ren og levedygtige primærelementer. I modsætning til cellelinjer aktiverer primærelementer isoleret fra transgene dyr for at undersøge konsekvenserne af genetiske modifikationer i vitro.
Her, er en metode til at isolere primære murine MMEC beskrevet ved hjælp af mekaniske og enzymatiske dissociation efterfulgt af magnetisk aktiveret celle sortering teknikker (MCS) for rensning. Til dette formål anvendes magnetiske perler mod specifikke overflade markører. Trombocyttal endotel celle vedhæftning molekyle-1 (PECAM1, CD31) er hovedsagelig udtrykt på EF og kan bruges til at berige denne celletype. For at garantere høj celle renhed, er hæmatopoietisk celler udelukket af en negativ selektion for protein tyrosin phosphatase receptor type C (PTPRC, CD45). Yderligere, kvalitetskontrol, dyrkning af primære murine MMEC, potentielle anvendelsesmuligheder og begrænsninger samt særlige overvejelser præsenteres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrovaskulære endotelceller give barriere funktioner i alle væv og deres dysfunktion resulterer i sygdom af tilknyttede organer 3. Desuden, orgel-specifikke undersøgelser af mikrovaskulære EF kunne bane vejen for nye terapeutiske strategier. En dybere forståelse af mikrovaskulære EF funktion under fysiologiske og patofysiologiske forhold er derfor af stor videnskabelig interesse. Graduering af leukocyt/endotelet interaktion bruges med succes til behandling af multipel sklerose patienter med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af “anden Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 til TR), “Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster” (I-RU211811 til TR) og tyske Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, mig 3283/5-1, og mig 3283/6-1 til SGM). Illustreret billeder leveres af Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
