Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen
Summary
Microvasculaire endotheliale cellen van skeletspieren (MMEC) vorm van de binnenwand van de spier haarvaten en reguleren beide, uitwisseling van vloeistoffen/moleculen en migratie van (afweercellen) tussen spierweefsel en bloed. Isolatie van primaire lymfkliertest MMEC, kunt zoals hier beschreven, u uitgebreide in vitro onderzoeken van de “myovascular-eenheid”.
Abstract
De endotheliale cellen van skeletspieren haarvaten (microvasculaire endothelial spiercellen, MMEC) opbouwen van de barrière tussen de bloedstroom en debeenderspieren regulering van de uitwisseling van vloeistoffen en voedingsstoffen, evenals de immuunrespons tegen besmettelijke agenten door immuun cel migratie te beheren. Voor deze functies, MMEC vormen een functionele “myovascular eenheid” (MVU), met verdere celtypen, zoals pericytes, fibroblasten en cellen van de skeletspieren. Bijgevolg een dysfunctie van MMEC en dus de MVU draagt bij aan een grote verscheidenheid van myopathieën. Echter regulerende mechanismen van MMEC bij gezondheid en ziekte blijven onvoldoende begrepen en hun opheldering voorafgaat aan meer specifieke behandelingen voor myopathieën. De isolatie en diepgaand onderzoek van de primaire functies van de MMEC in het kader van de MVU zou kunnen vergemakkelijken een beter inzicht in deze processen.
Dit artikel bevat een protocol om te isoleren van primaire lymfkliertest MMEC van de skeletspieren door mechanische en enzymatische dissociatie, met inbegrip van de zuivering en cultuur onderhoud stappen.
Introduction
Via de bloedbaan, cellen en organen zijn voorzien van zuurstof, substraten en andere noodzakelijke moleculen. Deze uitwisseling vindt plaats in de haarvaten, de kleinste vaartuigen. Haarvaten worden gevormd door een cellaag van de innerlijke endothelial (EG) waarvan de integriteit een voorwaarde voor succesvolle regulering van de homeostase van de spier tussen de intravasculaire en interstitiële ruimte blijft. Om te zorgen voor een selectieve overgang van oplosbare factoren en cellen, EG vormen een enkelgelaagde onderling verbonden door strak en adherens kruispunten 1. Naast haar rol als barrière voor voedingsstoffen of stofwisselingsproducten, EG regelen de aanwerving van leukocyten in inflammatoire processen. Ontsteking of weefsel schade leidt tot een up-regulatie van celadhesie-moleculen op het oppervlak van de EG en de productie van chemokines leukocyte bijlage en transmigratie in de target weefsel 2te vergemakkelijken. Bijgevolg zijn de EG kritisch betrokken bij de regulatie van inflammatoire processen zoals de verdediging tegen ziekteverwekkers of weefselherstel.
Een dysfunctie van de EG is direct gekoppeld aan vasculaire ziekten, chronisch nierfalen, veneuze trombose ernstige pathogen infecties. Bovendien EG zijn bijna altijd betrokken bij orgaan-specifieke autoimmuniteit zoals diabetes mellitus of multiple sclerose 3. De functie als barrière tussen bloed en organen wordt daarom beheerd door een gezamenlijke samenspel van verschillende celtypes. In de skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen (MMEC) samen met de spiercellen, fibroblasten en pericytes vormen een functionele eenheid, de “eenheid van de myovascular” (MVU). Daarom kan een dysfunctie van de MVU een cruciale rol spelen in de pathofysiologie van myopathieën. Echter een dieper begrip van deze regulerende mechanismen ontbreekt nog steeds en momenteel verzet zich tegen de identificatie van nieuwe, therapeutische en dringend noodzakelijke doelen in myopathieën.
Om te onderzoeken het complex fysiologische en pathofysiologische mechanismen, worden dierlijke modellen vaak gebruikt. Echter, in vitro modellen bieden het voordeel te concentreren op het onderwerp van belang door een scala aan storende factoren uit te sluiten. Om te onderzoeken processen in vitro er moet zuiver en levensvatbare primaire cellen isoleren. In tegenstelling tot de cellijnen toelaten primaire cellen geïsoleerd van transgene dieren om de gevolgen van genetische modificaties in vitro onderzoeken.
Een methode om te isoleren van de primaire lymfkliertest MMEC wordt hier beschreven met behulp van mechanische en enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische geactiveerde cel Sorteren technieken (MCS) voor de zuivering. Voor dit doel, worden magnetische kralen tegen specifieke oppervlakte markers gebruikt. Bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul-1 (PECAM1, CD31) wordt vooral uitgedrukt op EG en kan worden gebruikt voor het verrijken van dit celtype. Om te rechtvaardigen hoge cel zuiverheid, zijn cellen van hematopoietische oorsprong uitgesloten door een negatieve selectie voor proteïne tyrosine fosfatase receptor type C (PTPRC, CD45). Verder, kwaliteitscontroles, teelt van primaire lymfkliertest MMEC, toepassingsmogelijkheden en beperkingen, alsmede speciale overwegingen worden gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microvasculaire endotheliale cellen bieden barrière functies in alle weefsels en hun resultaten van de disfunctie bij ziekte van de bijbehorende organen 3. Bovendien, orgel-specifieke studies van microvasculaire EG kunnen de weg vrijmaken voor nieuwe therapeutische strategieën. Daarom is een dieper begrip van microvasculaire EG functie onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden van wetenschappelijke belangstelling. Modulatie van leukocyten/endotheel interactie is met succes gebruik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de “anders Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 aan TR), “Innovatieve Medizinische Forschung (IMF) Münster” (I-RU211811 aan TR) en Duitse Research Foundation (DFG INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 en ME 3283/6-1 tot SGM). Geïllustreerde knopvlakken door Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
