Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético
Summary
Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la “unidad myovascular”.
Abstract
Las células endoteliales de capilares del músculo esquelético (músculo microvascular las células endoteliales, MMEC) construcción la barrera entre la sangre y los músculos esqueléticos que regula el intercambio de fluidos y nutrientes así como la respuesta inmune contra infecciosas agentes de control de la migración de células inmunes. Para estas funciones, forman un funcional MMEC “unidad myovascular” (MVU), con más tipos de células, como fibroblastos y pericitos, células del músculo esquelético. Por lo tanto, una disfunción de MMEC y por lo tanto la MVU contribuye a una gran variedad de miopatías. Sin embargo, mecanismos de MMEC en la salud y la enfermedad siguen siendo insuficientemente comprendidos y su elucidación precede a tratamientos más específicos para miopatías. El aislamiento y la investigación en profundidad de funciones primarias de MMEC en el contexto de la MVU podrían facilitar una mejor comprensión de estos procesos.
Este artículo proporciona un protocolo para aislar MMEC murino primaria del músculo esquelético por la disociación mecánica y enzimática, incluyendo purificación y pasos de mantenimiento de la cultura.
Introduction
Órganos, células y a través de torrente sanguíneo están provistos de oxígeno, substratos y otras moléculas necesarias. Este intercambio tiene lugar en los capilares, los vasos más pequeños. Los capilares están formados por una capa interna células endoteliales (CE), cuya integridad es un pre-requisito para la exitosa regulación de la homeostasis del músculo entre el espacio intravascular e intersticial. Para asegurar una transición selectiva de células y factores solubles, CE constituyen un monocapa interconectados por apretada y de las ensambladuras de los adherens 1. Además de su papel como barrera para alimentos o productos metabólicos, CE regular el reclutamiento de leucocitos en los procesos inflamatorios. Inflamación o tejido daños conduce a una para arriba-regulación de moléculas de adhesión en la superficie de la CE y la producción de quimiocinas facilitando el apego del leucocito y transmigración en los tejidos de destino 2. En consecuencia, CE están implicados críticamente en la regulación de procesos inflamatorios como la defensa contra agentes patógenos o reparación de los tejidos.
Una disfunción de la CE está directamente asociada con enfermedades vasculares, la insuficiencia renal crónica, trombosis venosa grave patógeno infecciones. Además, CE casi siempre están implicadas en autoinmunidad órgano-específicas como diabetes mellitus o esclerosis múltiple 3. La función de barrera entre la sangre y órganos por lo tanto es controlada por una interacción concertada de diferentes tipos de células. En el músculo esquelético microvascular células endoteliales (MMEC) junto con las células musculares, fibroblastos y pericitos forman una unidad funcional, la “unidad myovascular” (MVU). Por lo tanto, una disfunción de la MVU pudo desempeñar un papel fundamental en la fisiopatología de las Miopatías. Sin embargo, una comprensión más profunda de estos mecanismos reguladores todavía falta y actualmente imposibilita la identificación de objetivos nuevos, urgentes, terapéuticos en las Miopatías.
Para investigar los mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos complejos, se utilizan modelos animales. Sin embargo, en vitro modelos ofrecen la ventaja de centrarse en el tema de interés mediante la exclusión de una gran variedad de factores de confusión. Para investigar los procesos in vitro es necesario aislar células primaria puras y viables. En contraste con las líneas celulares, células primarias aisladas de animales transgénicos permiten investigar las consecuencias de modificaciones genéticas in vitro.
Aquí, un método para aislar primaria MMEC murino se describe mediante el uso de disociación mecánica y enzimática, seguida de magnético celular activado clasificación técnicas (MCS) para la purificación. Para ello, se utilizan granos magnéticos contra marcadores de superficie específicos. Plaquetas endotelial de la célula molécula 1 de adhesión (PECAM1, CD31) se expresa principalmente en el CE y se puede utilizar para enriquecer este tipo celular. Para garantizar la pureza alta de la célula, las células de origen hematopoyético son excluidas por una selección negativa para la proteína tirosina fosfatasa receptor tipo C (PTPRC, CD45). Además, se presentan los controles de calidad, el cultivo de primaria MMEC murino, aplicaciones potenciales y limitaciones, así como consideraciones especiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células endoteliales microvasculares proporcionan funciones de barrera en todos los tejidos y los resultados de la disfunción en la enfermedad de los órganos asociados 3. Por otra parte, estudios de órgano-específicas de la CE microvascular podrían allanar el camino para nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, una comprensión más profunda de la función microvascular de CE bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas es de gran interés científico. Modulación de la inte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el “Else Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 TR), “Innovative Medizinische Forschung (FMI) Münster” (I-RU211811 a TR) y la Fundación alemana de investigación (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 y ME 3283/6-1 a las SGM). Ilustrado imágenes proporcionadas por Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
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