Isolering av primære Murine Skjelettmuskel mikrovaskulær endotelceller
Summary
Mikrovaskulær endotelceller i skjelettmuskulatur (MMEC) form indre veggen av muskel kapillærene og regulere begge, utveksling av væsker/molekyler og migrering av () immunceller mellom muskelvev og blod. Isolering av primære murine MMEC, kan som beskrevet her, omfattende i vitro undersøkelser av”myovascular”.
Abstract
Endotelceller i skjelettmuskulatur kapillærene (muskel mikrovaskulær endotelceller, MMEC) bygge opp barrieren mellom blod og muskler regulere utveksling av væsker og næringsstoffer, samt immunrespons mot smittsomme agenter ved å kontrollere immun celle migrasjon. For disse funksjonene, MMEC danne en funksjonell “myovascular enhet” (MVU), med ytterligere celletyper, for eksempel fibroblaster, pericytes og skjelettlidelser muskelceller. Derfor bidrar en dysfunksjon av MMEC og derfor MVU til et stort utvalg av myopathies. Imidlertid regulatoriske mekanismer for MMEC i helse og sykdom fortsatt utilstrekkelig forstått og deres forklaring foran mer spesifikke behandlinger for myopathies. Isolasjon og grundig undersøkelse av MMEC hovedfunksjoner i sammenheng med MVU kan gjøre en bedre forståelse av disse prosessene.
Denne artikkelen inneholder en protokoll for å isolere primære murine MMEC av skjelettmuskelen av mekanisk og enzymatiske dissosiasjon inkludert rensing og kultur vedlikehold trinn.
Introduction
Via blodbanen, cellene og organene leveres med oksygen, underlag og andre nødvendige molekyler. Denne utveksling foregår i kapillærene, minste fartøyene. Kapillærene er dannet av en indre endothelial celle (EC) lag som har integritet forblir en forutsetning for vellykket regulering av muskel homeostase mellom intravascular og interstitielle rommet. For å sikre en selektiv overgang av løselig faktorer og celler, EC utgjør en monolayer forbundet med fast og adherens veikryss 1. Foruten sin rolle som barriere for næringsstoffer eller metabolske produkter, EU regulere rekruttering av leukocytter i inflammatoriske prosesser. Betennelse eller vev skade fører til en opp-regulering av vedheft molekyler på EC overflaten og produksjon av chemokines tilrettelegge leukocytter vedlegg og transmigration i målet vev 2. Derfor EF er kritisk involvert i regulering av inflammatoriske prosesser som forsvar mot patogener eller reparasjon av vev.
En dysfunksjon av EC er direkte forbundet med vaskulær sykdom, kronisk nyresvikt, venetrombose alvorlig patogen infeksjoner. Videre EC er nesten alltid involvert i organ-spesifikke autoimmunitet som diabetes mellitus eller multippel sklerose 3. Funksjonen barriere mellom blod og organer er derfor styrt av et felles samspill mellom forskjellige celletyper. I skjelettmuskulatur mikrovaskulær endotelceller (MMEC) sammen med muskelceller, fibroblaster og pericytes utgjør en funksjonell enhet, “myovascular enhet” (MVU). Derfor kan en dysfunksjon av MVU spiller en avgjørende rolle i Patofysiologien ved myopathies. Men en dypere forståelse av disse regulatoriske mekanismene mangler fortsatt og nå utelukker identifisering av nye, presserende behov, terapeutiske mål i myopathies.
For å undersøke de komplekse fysiologiske og patofysiologiske mekanismene, brukes dyremodeller. Men tilbyr i vitro modeller fordelen med å fokusere på motivet av interesse ved å ekskludere en rekke forvirrende faktorer. Undersøke prosesser i vitro er det nødvendig å isolere ren og levedyktig primære celler. I motsetning til cellelinjer kan primær celler isolert fra transgene dyr undersøke konsekvensene av genetiske modifikasjoner i vitro.
Her er en metode for å isolere primære murine MMEC beskrevet ved hjelp av mekanisk og enzymatiske dissosiasjon etterfulgt av magnetiske aktivert celle sortering teknikker (MCS) for rensing. For dette formålet brukes magnetiske perler mot bestemte overflate markører. Blodplater endothelial celle vedheft molekyl-1 (PECAM1, CD31) er hovedsakelig uttrykt i EU og kan brukes til å berike denne celle type. For å garantere høyt renhet, utelates celler blodkreft opprinnelse som en negativ utvalg for protein tyrosin fosfatase reseptor type C (PTPRC, CD45). Videre presenteres kvalitetskontroll, dyrking av primære murine MMEC, potensielle og begrensninger i tillegg til spesielle hensyn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrovaskulær endotelceller gir barriere funksjonene i alle vev og dysfunksjon resultatene i sykdom av tilknyttede organer 3. Videre kunne organ-spesifikke studier av mikrovaskulær EC bane vei for nye strategier. Derfor er en dypere forståelse av mikrovaskulær EC-funksjonen under fysiologiske og patofysiologiske forhold av stor vitenskapelig interesse. Modulering av leukocytter/endotelet samhandling er brukt til å behandle multippel sklerose pasienter med natalizumab, et antistoff som hindrer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av den “andre Kröner-Fresenius-Stiftung» (2018_A03 til TR),”Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster”(I-RU211811 til TR) og tysk Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, meg 3283/5-1 og meg 3283/6-1 til SGM). Illustrert bilder gitt av Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
