Isolering av primära murina skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller
Summary
Mikrovaskulära endotelceller i skelettmuskulaturen (MMEC) forma den inre väggen av muskel kapillärer och reglera båda, utbyte av vätskor/molekyler och migration av (immunceller) mellan muskelvävnad och blod. Isolering av primära murina MMEC, kan som beskrivs här, omfattande in vitro-undersökningar av enheten ”myovascular”.
Abstract
Endotelceller i skelettmuskulaturen kapillärerna (muskel mikrovaskulära endotelceller, MMEC) bygga upp barriären mellan blodet och skelettmuskulaturen reglerar utbyte av vätskor och näringsämnen samt immunsvaret mot smittsamma agenter genom att kontrollera immunceller migration. För dessa funktioner, MMEC bildar en funktionell ”myovascular unit” (MVU), med ytterligare celltyper, såsom fibroblaster, pericyter och skelettmuskel celler. Följaktligen, en dysfunktion i MMEC och därför MVU bidrar till en stor mängd myopatier. Dock regleringsmekanismer av MMEC i hälsa och sjukdom förbli otillräckligt förstådda och deras klargörande föregår mer specifika behandlingar för myopatier. Isolering och djupgående utredning av primära MMEC funktioner i samband med MVU kan underlätta en bättre förståelse av dessa processer.
Denna artikel tillhandahåller ett protokoll för att identifiera primära murina MMEC av skelettmuskulaturen med mekaniska och enzymatisk dissociation inklusive rening och kultur underhåll steg.
Introduction
Via blodbanan, celler och organ levereras med syre, substrat och andra nödvändiga molekyler. Detta utbyte sker i kapillärerna, de minsta kärlen. Kapillärer bildas genom ett inre endotelceller (EG) lager vars integritet är fortfarande en förutsättning för framgångsrik reglering av muskel homeostas mellan det intravaskulära och interstitiell utrymmet. För att säkerställa en selektiv övergång av lösliga faktorer och celler, EG utgör en enskiktslager sammankopplade med tight och adherens föreningspunkter 1. Förutom sin roll som barriär för näringsämnen eller metaboliska produkter reglera EG rekrytering av leukocyter i inflammatoriska processer. Inflammation eller vävnad skada leder till en Uppregleringen av adhesionsmolekyler på EG ytan och produktion av kemokinerna underlätta leukocyt fastsättning och själavandring in i målet vävnad 2. EG är därför kritiskt involverade i regleringen av inflammatoriska processer såsom försvar mot patogener eller vävnad reparera.
En dysfunktion i EG är direkt associerade med vaskulära sjukdomar, kronisk njursvikt, venös trombos svår patogen infektioner. EG är dessutom nästan alltid involverade i organ-specifika autoimmunitet såsom diabetes mellitus eller multipel skleros 3. Barriärfunktionen mellan blodet och organ styrs därför av ett samordnat samspel av olika celltyper. I skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller (MMEC) tillsammans med muskelceller, fibroblaster och pericyter bildar en funktionell enhet, enhetens ”myovascular” (MVU). Därför kan en dysfunktion i MVU spelar en avgörande roll i patofysiologin bakom myopatier. Dock en djupare förståelse för dessa reglerande mekanismer saknas fortfarande och för närvarande utgör hinder för identifiering av nya, brådskande, terapeutiska mål i myopatier.
För att undersöka de komplexa fysiologiska och patofysiologiska mekanismerna, används djurmodeller ofta. In vitro- modeller erbjuder emellertid fördelen att fokusera på föremål för intresse genom att utesluta en mängd störfaktorer. För att undersöka processer in vitro-är det nödvändigt att isolera ren och livskraftig primära celler. I motsats till cellinjer aktivera primära celler isolerade från transgena djur för att undersöka konsekvenserna av genetiska modifieringar in vitro.
Här beskrivs en metod för att isolera primära murina MMEC med hjälp av mekaniska och enzymatisk dissociation följt av magnetiska aktiverad cell sortering tekniker (MCS) för rening. För detta ändamål används magnetiska pärlor mot specifika yta markörer. Trombocytantal endothelial celladhesionsmolekyl-1 (PECAM1, CD31) uttrycks huvudsakligen på EG och kan användas för att berika denna celltyp. För att garantera hög cell renhet, utesluts celler av hematopoetiska ursprung som ett negativt urval för protein tyrosin fosfatas receptor typ C (PTPRC, CD45). Ytterligare, kvalitetskontroller, odling av primära murina MMEC, potentiella tillämpningar samt begränsningar och särskilda överväganden presenteras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrovaskulära endotelceller ge barriär funktioner i alla vävnader och deras dysfunktion resultat vid sjukdom av associerade organ 3. Dessutom kunde organ-specifika studier av mikrovaskulära EG bana väg för nya terapeutiska strategier. En djupare förståelse för mikrovaskulära EG funktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden är därför av stort vetenskapligt intresse. Modulering av leukocyter/endotel interaktion används framgångsrikt att behandla multipel skleros pat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av den ”annat Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 i TR), ”innovativa Medizinische Forschung (IMF) Münster” (I-RU211811 till TR) och tyska Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, mig 3283/5-1, och mig 3283/6-1 till SGM). Illustrerade bilder som tillhandahålls av Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
References
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
