تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد تربط الدوائر الدقيقة وصور الدماغ على نطاق كبير في بروتوكول تضمين متداخلثلاثي الأبعاد
Summary
يقدم هذا المقال بروتوكول تجريبي باستخدام تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد التي تربط بين مقياسين مكانيين: المقياس المكاني العياني للتشريح في الدماغ الكامل الذي صوره التصوير بالرنين المغناطيسي في > 100 ميكرومتر والمقياس المكاني المجهري لتوزيع الخلايا العصبية باستخدام تلطيخ الكيمياء المناعية ونظام صفيف متعدد الأقطاب وطرق أخرى (~ 10 درجة مئوية).
Abstract
الدماغ البشري، كونه نظام متعدد الدرجات، على حد سواء إشارات كهربائية مجهرية، تتدفق على الصعيد العالمي على طول حزم الألياف البيضاء سميكة، والمسامير العصبية المجهرية، ونشر على طول المحاور وdendrites. ويكمل كلا الجدولين جوانب مختلفة من الوظائف المعرفية والسلوكية البشرية. على المستوى العياني، كان التصوير بالرنين المغناطيسي هو تكنولوجيا التصوير القياسية الحالية، حيث أصغر دقة مكانية، حجم voxel، هو 0.1-1 مم3. أيضا، على المستوى المجهري، كانت الدراسات الفسيولوجية السابقة على بينة من البنى العصبية غير موحدة داخل هذه voxels. تطور هذه الدراسة طريقة قوية لدمج البيانات المجهرية بدقة في خريطة مجهرية من خلال ربط البحث العلمي البيولوجي مع التقدم التكنولوجي في تكنولوجيا المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد. منذ 3D تكنولوجيا المسح الضوئي وقد استخدمت في الغالب للهندسة والتصميم الصناعي حتى الآن، يتم إعادة استخدامها لأول مرة لتضمين microconnectomes في الدماغ كله مع الحفاظ على الصنبور الطبيعي في خلايا الدماغ الحية. من أجل تحقيق هذا الغرض، أولا، قمنا بإنشاء بروتوكول المسح الضوئي للحصول على صور دقيقة 3D من الكائنات الحية الحية التي تشكل تحديا بطبيعتها للصورة بسبب الأسطح الرطبة والعاكسة. ثانيا، تدربنا على الحفاظ على السرعة لمنع تدهور أنسجة الدماغ الحية، وهو عامل رئيسي في الحفاظ على ظروف أفضل وتسجيل المزيد من المسامير العصبية الطبيعية من الخلايا العصبية النشطة في أنسجة الدماغ. تظهر صورتان على سطح القشرية، تم استخراجهما بشكل مستقل من وحدتين مختلفتين للتصوير، وهما التصوير بالرنين المغناطيسي والصور السطحية للماسح الضوئي ثلاثي الأبعاد، خطأ ً في المسافة لا يتجاوز 50 ميكرومتر كقيمة وضع للرسم البياني. هذه الدقة قابلة للمقارنة من حيث الحجم إلى القرار المجهري للمسافات بين الخلايا؛ أيضا، فمن مستقر بين الفئران الفردية المختلفة. هذا البروتوكول الجديد، و3D الجديدة تضمين بروتوكول متداخلة (3D-NEO)، والجسور مستويات العيان ية والمجهرية المستمدة من هذا البروتوكول التكاملي وتسريع النتائج العلمية الجديدة لدراسة بنيات الاتصال الشامل (أي، microconnectome).
Introduction
عادة ما توجد البنى متعددة الدرجات غير الموحدة في مختلف المنظمات الفيزيائية والبيولوجية1،2. الدماغ هو أيضا منظمة شبكة غير موحدة جدا ومتعددة النطاق3،4. يتم ترميز الوظائف المعرفية المختلفة في مثل هذه المنظمات الشبكة، وعقد التغيرات الزمنية لأنماط ارتفاع الكهربائية من السكان الخلايا العصبية في القرارات الزمنية submillisecond. تاريخيا، لوحظت الشبكات المعقدة بين الخلايا العصبية هيكليا بالتفصيل باستخدام تقنيات تلطيخ من قبل سانتياغو رامون y Cajal من أكثر من 150 عاما مضت5. لمراقبة السلوكيات الجماعية للخلايا العصبية النشطة، طور الباحثون تقنيات تسجيل مختلفة6و7و8، وقد مكنتنا التطورات الهامة الأخيرة من هذه التقنيات من تسجيل الأنشطة الكهربائية من أعداد كبيرة من الخلايا العصبية في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، من هذه الأنشطة الوظيفية، نجح العلماء في إعادة بناء شبكات من التفاعلات السببية بين أعداد كبيرة من الخلايا العصبية وأعلنوا الهندسة الطوبوغرافية لتفاعلاتهم المعقدة ‘microconnectome’9 . كما تسمح الملاحظات العيانية للدماغ باعتبار الدماغ بأكمله منظمة للشبكة لأن العديد من مناطق الدماغ متصلة بحزم ألياف متعددة. إن إدماج الكُمَكَمّات الدقيقة في خريطة الدماغ العالمية لا يزال له حدود واضحة ضمن التطورات التكنولوجية الحالية، وهذا هو السبب في أن بروتوكول التضمين هذا مهم جداً. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات لتطوير بروتوكول التضمين. على سبيل المثال، من أجل مراقبة أنشطة الدوائر العصبية المحلية الحية في مناطق الدماغ المعزولة بحتة، تحتاج شرائح الدماغ إلى إنتاج للتسجيلات في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال التسجيلات من شرائح الدماغ للتسجيلات في المختبر خياراً هاماً لسببين على الأقل. أولا، لا يزال من غير السهل مراقبة أنشطة العديد من الخلايا العصبية الفردية الحية في وقت واحد من مناطق الدماغ أعمق من ~ 1.5 ملم وفي دقة زمنية عالية (<1 مللي ثانية). ثانيا، عندما نأمل أن نعرف البنية الداخلية للدائرة العصبية المحلية، ونحن بحاجة إلى وقف جميع المدخلات القادمة من مناطق الدماغ الخارجية للقضاء على العوامل المربكة. من أجل تحديد الاتجاهات والمواقف من شرائح الدماغ المنتجة، سيكون من الضروري كذلك لدمج المواقف المكانية لهذه شرائح الدماغ المنتجة باستخدام الإحداثيات. هناك، ومع ذلك، هناك عدد قليل من الطرق المنهجية وموثوق بها لجعل شرائح الدماغ بطريقة منظمة10،11. هنا، يتم إدخال بروتوكول جديد للتسجيل المشترك، باستخدام تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد للبحث العلمي العصبي من أجل توفير بروتوكول تكاملي. يعمل هذا البروتوكول على تنسيق المقاييس الدقيقة والكلية وتضمين مجموعة متعددة الأقطاب (MEA) microdata12و13 وتلطيخ البيانات على مساحة التصوير بالرنين المغناطيسي العياني من خلال أسطح المسح الضوئي ثلاثية الأبعاد للعقول المستخرجة، وكذلك من العقول المسجلة غير الغازية. ومن المستغرب، وهذا أظهر خطأ المسافة من ~ فقط 50 ميكرومتر كقيمة وضع الرسم البياني. ونتيجة لذلك، كانت قيم وضع الحد الأدنى للمسافات بين سطح التصوير بالرنين المغناطيسي وسطح 3D الممسوحة ضوئيا ً حوالي 50 ميكرومتر لجميع الفئران الستة، وهو رقم مناسب عند التحقق من القواسم المشتركة بين الأفراد. وكان عرض شريحة نموذجية نشاط ارتفاع مسجل من حوالي 300 ميكرومتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد طورنا بروتوكولا جديدا يسمى بروتوكول الـ 3D-NEO لسد المقاييس المكانية العيانية والمجهرية عن طريق تداخل سطحين من أسطح الدماغ بدقة أكبر من ذي قبل. في الأصل، كان هناك تحديان في إنشاء هذا البروتوكول الذي جعل من الممكن التداخل الدقيق لصورتين سطح الدماغ وتسجيل الأنشطة العصبية الصحية من الكائن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تشعر الأستاذة بالامتنان للدعم الذي تقدمه جميع الموظفين في دورة هندسة المعلومات الطبية في كلية الدراسات العليا للطب وكلية الطب، وترغب في شكر البروفيسور تيتسويا تاكاكوا، والبروفيسور نوبوكاتسو ساواموتو، ودوريس زاكيان على ما قدموه من مساعدة تعليقات. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة في المعونة لتحدي البحوث الاستكشافية والمبادرة الرائدة للباحثين الشباب الممتاز (LEADER) برنامج إلى M.S. من MEXT (وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا). وقد أجريت تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي في هذا العمل في شعبة التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانية الصغيرة، ومركز دعم البحوث الطبية، وكلية الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو، اليابان.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
