3D-Scanning-Technologie Überbrückung von Mikroschaltungen und Makroskalen-Gehirnbildern in 3D-Neuartigem Einbetten von Überlappungsprotokollen
Summary
Dieser Artikel stellt ein experimentelles Protokoll vor, das die 3D-Scanning-Technologie verwendet, die zwei räumliche Skalen überbrückt: die makroskopische räumliche Skala der Anatomie des gesamten Gehirns, die durch die MRT auf >100 m abgebildet wird, und die mikroskopische räumliche Skala neuronaler Verteilungen unter Verwendung von immunhistochemische Färbung und ein Multielektroden-Array-System und andere Methoden (ca. 10 m).
Abstract
Das menschliche Gehirn, ein Multiskalensystem, hat sowohl makroskopische elektrische Signale, die global entlang dicker weißer Faserbündel fließen, als auch mikroskopische neuronale Spitzen, die sich entlang axons und dendriten ausbreiten. Beide Skalen ergänzen verschiedene Aspekte der menschlichen kognitiven und Verhaltensfunktionen. Auf makroskopischer Ebene ist die MRT die aktuelle Standard-Bildgebungstechnologie, bei der die kleinste räumliche Auflösung, die Voxelgröße, 0,1–1 mm3beträgt. Auch auf mikroskopischer Ebene waren sich frühere physiologische Studien ungleichmäßiger neuronaler Architekturen innerhalb solcher Voxel bewusst. Diese Studie entwickelt eine leistungsstarke Möglichkeit, mikroskopische Daten genau in eine makroskopische Karte einzubetten, indem biologische wissenschaftliche Forschung mit technologischen Fortschritten in der 3D-Scanning-Technologie in Verbindung gebracht wird. Da die 3D-Scanning-Technologie bisher vor allem für Engineering und Industriedesign eingesetzt wurde, wird sie erstmals umfunktioniert, um Mikroconnectome in das gesamte Gehirn einzubetten und dabei das natürliche Spiking in lebenden Gehirnzellen zu erhalten. Um diesen Zweck zu erreichen, haben wir zunächst ein Scanprotokoll erstellt, um genaue 3D-Bilder von lebenden Bioorganismen zu erhalten, die aufgrund feuchter und reflektierender Oberflächen von Natur aus eine Herausforderung für das Bild darstellen. Zweitens haben wir trainiert, um die Geschwindigkeit zu halten, um den Abbau von lebendem Hirngewebe zu verhindern, was ein Schlüsselfaktor für die Beibehaltung besserer Bedingungen und die Aufzeichnung natürlicherer neuronaler Spitzen aus aktiven Neuronen im Gehirngewebe ist. Zwei kortikale Oberflächenbilder, die unabhängig voneinander aus zwei verschiedenen Bildgebungsmodulen extrahiert werden, nämlich MRT- und 3D-Scanner-Oberflächenbilder, zeigen überraschenderweise einen Entfernungsfehler von nur 50 m als Moduswert des Histogramms. Diese Genauigkeit ist in der Skala mit der mikroskopischen Auflösung interzellulärer Entfernungen vergleichbar; auch, Es ist stabil unter verschiedenen einzelnen Mäusen. Dieses neue Protokoll, das 3D-Roman-Einbettungsprotokoll (3D-NEO), überbrückt makroskopische und mikroskopische Ebenen, die durch dieses integrative Protokoll abgeleitet werden, und beschleunigt neue wissenschaftliche Erkenntnisse, um umfassende Konnektivitätsarchitekturen zu untersuchen (d. h. Mikroconnectom).
Introduction
Uneinheitliche multiskalen Architekturen in verschiedenen physikalischen und biologischen Organisationen sind häufig gefunden1,2. Das Gehirn ist auch eine sehr uneinheitliche und multiskalige Netzwerkorganisation3,4. Verschiedene kognitive Funktionen sind in solchen Netzwerkorganisationen kodiert, die zeitliche Veränderungen der elektrischen Spitzenmuster neuronaler Populationen in submillisekundenzeitlichen Auflösungen halten. Historisch gesehen wurden die komplexen Netzwerke zwischen Neuronen strukturell detailliert beobachtet, indem man die Färbetechniken von Santiago Ramon y Cajal von vor über 150 Jahrenverwendete 5. Um das Gruppenverhalten aktiver Neuronen zu beobachten, haben forscher verschiedene Aufzeichnungstechnologien entwickelt6,7,8, und die jüngsten bedeutenden Entwicklungen solcher Technologien haben es uns ermöglicht, elektrische Aktivitäten von einer großen Anzahl von Neuronen gleichzeitig. Darüber hinaus ist es Wissenschaftlern aus solchen funktionellen Aktivitäten gelungen, Netzwerke kausaler Wechselwirkungen zwischen einer großen Anzahl von Neuronen zu rekonstruieren und die topologische Architektur ihrer komplexen Wechselwirkungen als “Mikroconnectom” bezeichnet zu haben9 . Makroskopische Beobachtungen des Gehirns ermöglichen auch die Bezug auf ein ganzes Gehirn als Netzwerkorganisation, da viele Hirnregionen durch mehrere Faserbündel verbunden sind. Die Einbettung von Mikroconnectomen in die globale Hirnkarte hat immer noch klare Grenzen innerhalb des aktuellen technologischen Fortschritts, weshalb dieses Einbettungsprotokoll so wichtig ist. Die Entwicklung des Einbettungsprotokolls stellt jedoch viele Herausforderungen dar. Um beispielsweise Aktivitäten lebender lokaler neuronaler Schaltkreise in rein isolierten Hirnregionen zu beobachten, müssen Hirnscheiben für In-vitro-Aufnahmen produziert werden. Darüber hinaus sind Aufnahmen von Gehirnscheiben für In-vitro-Aufnahmen aus mindestens zwei Gründen immer noch eine wichtige Wahl. Erstens ist es immer noch nicht einfach, Aktivitäten vieler lebender einzelner Neuronen gleichzeitig aus Hirnregionen zu beobachten, die tiefer als 1,5 mm und in hoher zeitlicher Auflösung (<1 ms) liegen. Zweitens, wenn wir hoffen, die interne Architektur eines lokalen neuronalen Schaltkreises zu kennen, müssen wir alle Eingaben aus externen Gehirnregionen stoppen, um verwirrende Faktoren zu beseitigen. Um die Richtungen und Positionen der produzierten Hirnscheiben zu identifizieren, wird es weiterhin notwendig sein, die räumlichen Positionen dieser produzierten Gehirnscheiben mithilfe von Koordinaten zu integrieren. Es gibt jedoch ein paar systematische und zuverlässige Möglichkeiten, Gehirnscheiben in organisierter Weise zu machen10,11. Hier wird ein neues Co-Registrierungsprotokoll eingeführt, das 3D-Scanning-Technologie für die neurowissenschaftliche Forschung nutzt, um ein integratives Protokoll zu liefern. Dieses Protokoll dient der Koordination von Mikro- und Makroskalen und der Einbettung von Multielektroden-Array (MEA)-Mikrodaten12,13 und Der Färbung von Daten auf einen makroskopischen MRT-Raum durch 3D-Scan-Oberflächen von extrahierten Gehirnen sowie nicht invasiv aufgezeichnete Gehirne. Überraschenderweise zeigte dies einen Entfernungsfehler von nur 50 m als Moduswert des Histogramms. Infolgedessen lagen die Moduswerte der Mindestabstände zwischen zwei Oberflächen zwischen der MRT-Oberfläche und der gescannten 3D-Oberfläche für alle sechs Mäuse bei fast 50 m, was bei der Überprüfung auf Gemeinsamkeit unter Individuen eine geeignete Zahl darstellt. Die typische Schnittbreite hatte eine aufgezeichnete Spitzenaktivität von ca. 300 m.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein neues Protokoll namens 3D-NEO-Protokoll entwickelt, um makroskopische und mikroskopische räumliche Skalen zu überbrücken, indem zwei Gehirnoberflächen genauer als zuvor überlappen. Ursprünglich gab es zwei Herausforderungen bei der Erstellung dieses Protokolls, das die genaue Überlappung zweier Gehirnoberflächenbilder ermöglichte und gesunde neuronale Aktivitäten von lebenden Organismen aufzeichnete. Erstens war es notwendig, die Schneidlösung, die das extrahierte Gehirn umgibt, effektiv abzuwisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S. ist dankbar für die Unterstützung aller Mitarbeiter des medizinischen Informatikkurses in der Graduate School of Medicine und der Medizinischen Fakultät und dankt Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto und Doris Zakian für ihre hilfreiche Kommentare. Diese Studie wurde von einem Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research und dem Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) Programm an M.S. von MEXT (Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie) unterstützt. Die MRT-Experimente in dieser Arbeit wurden in der Abteilung für Kleintier-MRT, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan durchgeführt.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
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