3D-scanning teknik överbrygga mikrokretsar och Macroscale hjärn bilder i 3D roman bädda överlappande protokoll
Summary
Denna artikel introducerar ett experimentellt protokoll med 3D-scanning teknik överbrygga två rumsliga skalor: den makroskopiska rumsliga skalan av hela hjärnans anatomi avbildas av MRT vid > 100 μm och den mikroskopiska rumsliga skalan av neuronala distributioner med hjälp av immunohistokemi färgning och en multielektrod array system och andra metoder (~ 10 μm).
Abstract
Den mänskliga hjärnan, som är ett flerskalig system, har både makroskopiska elektriska signaler, globalt flyter längs tjocka vita partiklar fiber buntar, och mikroskopiska neuronala spikar, förökningsmaterial längs axoner och dendriter. Båda skalorna kompletterar olika aspekter av människans kognitiva och beteendemässiga funktioner. Vid makroskopisk nivå har MRI varit den nuvarande standarden Imaging Technology, där den minsta rumsliga upplösningen, Voxel storlek, är 0,1-1 mm3. Även på mikroskopisk nivå, tidigare fysiologiska studier var medvetna om icke-enhetliga neuronala arkitekturer inom sådana voxels. Denna studie utvecklar ett kraftfullt sätt att korrekt bädda in mikroskopiska data i en makroskopisk karta genom att gränssnitt biologisk vetenskaplig forskning med tekniska framsteg i 3D-scanning teknik. Eftersom 3D-scanning teknik har mestadels använts för ingenjörskonst och industridesign fram till nu, det är återanvänt för första gången att bädda in microconnectomes i hela hjärnan och samtidigt bevara naturliga tillspikning i levande hjärnceller. För att uppnå detta syfte, först, konstruerade vi ett skannings protokoll för att få exakt 3D-bilder från levande bio-organismer till sin natur utmanande att bilden på grund av fuktiga och reflekterande ytor. För det andra, vi utbildade för att hålla hastigheten för att förhindra nedbrytning av levande hjärnvävnad, vilket är en nyckelfaktor för att behålla bättre villkor och registrera mer naturliga neuronala spikar från aktiva nervceller i hjärnvävnaden. Två kortikala yta bilder, oberoende ur två olika Imaging moduler, nämligen MRI och 3D-skanner yta bilder, överraskande Visa ett avstånds fel på endast 50 μm som läge värdet av histogrammet. Denna noggrannhet är jämförbar i skala till den mikroskopiska upplösningen av intercellulära avstånd; Dessutom är det stabilt bland olika enskilda möss. Detta nya protokoll, 3D-romanen bädda överlappande (3D-NEO) protokoll, broar makroskopiska och mikroskopisk nivåer som härrör från detta integrerande protokoll och påskyndar nya vetenskapliga rön att studera omfattande anslutning arkitekturer (dvs. mikroconnectome).
Introduction
Icke-enhetliga flerskaliga arkitekturer på olika fysiska och biologiska organisationer finns vanligtvis1,2. Hjärnan är också en mycket NonUniform och Multiscale knyter kontakt organisation3,4. Olika kognitiva funktioner kodas i sådana nätverk organisationer, hålla temporala förändringar av elektriska Spike mönster av neuronala populationer i submillisekund temporala resolutioner. Historiskt sett, de komplexa nätverken bland nervceller var strukturellt observerats i detalj med hjälp av färgning tekniker av Santiago Ramón y Cajal från över 150 år sedan5. För att observera grupp beteenden av aktiva nervceller, forskare har utvecklat olika inspelningsteknik6,7,8, och den senaste tidens betydande utvecklingen av sådan teknik har gjort det möjligt för oss att spela in elektriska aktiviteter från ett enormt antal nervceller samtidigt. Dessutom, från sådan funktionell verksamhet, har forskarna lyckats rekonstruera nätverk av kausala interaktioner mellan ett stort antal nervceller och har förklarat den topologiska arkitekturen i deras komplexa interaktioner “microconnectome”9 . Makroskopiska observationer av hjärnan också möjliggöra om en hel hjärna som en nätverksorganisation eftersom många hjärnregioner är anslutna med flera fiber-buntar. Inbäddning av microconnectomes i den globala hjärn kartan har fortfarande tydliga begränsningar inom nuvarande teknologiska framsteg, varför detta inbäddnings protokoll är så viktigt. Det finns dock många utmaningar för utvecklingen av inbäddnings protokollet. Till exempel för att observera aktiviteter av levande lokala neuronala kretsar i rent isolerade hjärnregioner, hjärn skivor måste produceras för in vitro-inspelningar. Dessutom är inspelningar från hjärn skivor för in vitro-inspelningar fortfarande ett viktigt val av minst två anledningar. För det första är det fortfarande inte lätt att observera aktiviteter för många levande enskilda nervceller samtidigt från hjärnregioner djupare än ~ 1,5 mm och i hög temporala upplösning (< 1 MS). För det andra, när vi hoppas att veta den interna arkitekturen i en lokal neuronala krets, måste vi stoppa alla ingångar som kommer från externa hjärnregioner för att eliminera confounding faktorer. För att identifiera riktningar och positioner av producerade hjärn skivor, kommer det att vara ytterligare nödvändigt att integrera de rumsliga positionerna för dessa producerade hjärn skivor med hjälp av koordinater. Det finns dock några systematiska och pålitliga sätt att göra hjärn skivor på ett organiserat sätt10,11. Här introduceras ett nytt coregistration Protocol, med hjälp av 3D-scanning teknik för neurovetenskaplig forskning för att ge ett integrativt protokoll. Detta protokoll fungerar för att samordna mikro-och macroscales och bädda in multielektrod array (MEA) mikrodata12,13 och färgning data på ett makroskopiskt MRI utrymme genom 3D Scan ytor av extraherade hjärnor, samt av noninvasivt inspelade hjärnor. Överraskande, detta visade ett avstånds fel på endast ~ 50 μm som läge värdet av histogrammet. Det innebär att läges värden för minsta avstånd mellan två ytor mellan MRI-ytan och den skannade 3D-ytan var nästan 50 μm för alla sex möss, vilket är ett lämpligt antal vid kontroll av gemensamhet bland individer. Den typiska segment bredden hade en inspelad spik aktivitet på cirka 300 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklade ett nytt protokoll som kallas 3D-NEO-protokollet för att överbrygga makroskopiska och mikroskopisk rumsliga skalor genom att överlappa två hjärn ytor mer exakt än tidigare. Ursprungligen fanns det två utmaningar i att skapa detta protokoll som gjorde det möjligt att exakt överlappning av två hjärnan yta bilder och inspelning friska neuronala aktiviteter från levande organismer. Först var det nödvändigt att effektivt torka skär lösning som omger den extraherade hjärnan efter extrahering av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS är tacksam för stöd från alla anställda i medicinsk information Engineering kurs i forskarskolan för medicin och medicinska fakulteten, och vill tacka prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, och Doris Zakian för deras hjälpsamma Kommentarer. Denna studie stöddes av ett bidrag-in-Aid för utmanande undersökande forskning och av det ledande initiativet för utmärkt unga forskare (LEADER) program till MS från MEXT (ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik). MRI-experimenten i detta arbete utfördes i avdelningen för små djur MRI, Medical Research Support Center, forskarskolan i medicin, Kyoto University, Japan.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
