Påvisning af Protease aktivitet af fluorescerende peptid Zymography
Summary
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for en modificeret zymographic teknik hvor fluorescerende peptider bruges som de nedbrydelige substrat i stedet for native proteiner. Elektroforese af biologiske prøver i fluorescerende peptid zymograms giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af proteaser end tidligere zymographic teknikker.
Abstract
Formålet med denne metode er at måle den proteolytiske aktivitet af komplekse biologiske prøver. Prøverne er adskilt af Molekylær vægt ved hjælp af elektroforese gennem en løsning gel indlejret med et nedbrydeligt substrat. Denne metode adskiller sig fra traditionelle gel zymography, idet en slukket fluorogenic peptid er kovalent indarbejdet i den løse gel i stedet for fuld længde proteiner, såsom gelatine eller kasein. Brug af fluorogenic peptider muliggør direkte påvisning af proteolytiske aktivitet uden yderligere farvning skridt. Enzymer i biologiske prøver kløver bratkølet fluorogenic peptid, hvilket resulterer i en stigning i fluorescens. Den fluorescerende signal i geler er derefter afbildet med en standard fluorescerende gel scanner og kvantificeres ved hjælp af densitometri. Brugen af peptider som nedbrydeligt underlaget i høj grad udvider de mulige proteaser påvises med zymographic teknikker.
Introduction
Gel zymography er en biologisk teknik, der anvendes til at måle proteolytiske aktivitet inden for biologiske prøver, kropsvæsker eller celle kultur medier1,2,3. Prøverne er adskilt af deres molekylære vægte med elektroforese gennem en polyacrylamid gel indlejret med et nedbrydeligt substrat. Fælles nedbrydeligt substrater inkluderer gelatine, kasein, kollagen og elastin, som har været brugt til at måle aktivitet af matrix metalloproteinases (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 og -11, ud over en række cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. efter elektroforese, enzymerne, der er renatured og lov til at nedbryde protein i gelen. I traditionelle gel zymography, gelen er plettet med et protein farvestof, såsom Coomassie blå, og protease aktivitet registreres som et tab af signal, dvs. hvid bands (nedbrydning af protein) på en blå baggrund.
Her, beskriver vi en protokol for en alternativ metode til gel zymography, hvor de nedbrydelige substrat er en kort, fluorogenic peptid kovalent indarbejdet i polyacrylamid gel (figur 1). Substitution af syntetiske peptider som de nedbrydelige substrater giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af proteaser i forhold til traditionelle gel zymography med native proteiner9. Kovalente sammenkædning af fluorogenic peptid forhindrer peptid diffusion og migration under gelelektroforese observeret med tidligere metoder9,10. Derudover muliggør brugen af en fluorogenic substrat direkte påvisning af protease aktivitet uden yderligere farvning og de-farvning trin. Det overordnede mål med denne metode er påvisning af protease aktivitet i biologiske prøver via den kovalente indarbejdelse af fluorogenic peptider i zymogram geler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuværende zymographic teknikker stole på inkorporering af indfødte substrater i polyacrylamidgeler til påvisning af proteolyse. Mens disse teknikker har vundet udbredelse, er de stadig begrænset antallet af proteaser de kan opdage. Her, blev en protokol, der beskrevet i hvilke fluorescerende, protease-nedbrydeligt peptider er indarbejdet i polyacrylamid løsning gel. Kovalente kobling ved hjælp af en azido-PEG3-maleimide linker molekyle muliggør adskillelse og påvisning af en bredere vifte af proteaser end er i ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ydes støtte ved The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering Department og Comprehensive Cancer Center – Arthur G. James Cancer Hospital og Richard J. Solove Research Institute.
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
