蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出
Summary
ここでは、代わりにネイティブ蛋白質分解性基質として蛍光ペプチドを使用する変更におけるザイモグラムの技術のための詳しいプロトコルを提案する.蛍光ペプチド手技で生体試料の電気泳動におけるザイモグラムの前の技術よりも幅広いプロテアーゼの検出が有効にします。
Abstract
このメソッドの目的は、複雑な生物学的サンプルのタンパク質分解活性を測定することです。サンプルは、分解性基板が埋め込まれた解決のゲルを通した電気泳動を用いた分子量で区切られます。このメソッドは、伝統的なゲル ザイモグラフィーと異なり、焼入れ蛍光ペプチド、ゼラチン、カゼインなどの完全な長さの蛋白質ではなく解決のゲルに組み込まれて共有ができます。蛍光ペプチド追加染色手順なしのプロテアーゼ活性の直接検出を使用します。生体試料中の酵素はクリーブ蛍光性の増加の結果、焼入れ蛍光ペプチドです。ゲルの蛍光信号が標準的な蛍光スキャナーで画像化し、デンシトメトリーを用いて定量化します。分解性基質ペプチドの使用におけるザイモグラムを用いて検出可能なプロテアーゼを大きく広げます。
Introduction
ゲル ザイモグラフィーは、体液や細胞培養媒体1,2,3などの生体サンプル中のプロテアーゼ活性を測定する使用生物学的手法です。サンプルは分解性基板が埋め込まれたポリアクリルアミドのゲルを通した電気泳動とその分子量によって区切られます。ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、エラスチン、マトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)-1、-2、-3、-7、-8、-9、-11、カテプシン1,2のさまざまなの活動を測定するために使用されている一般的な分解性基板が含まれます,4,5,6,7,8. 電気泳動後、酵素 renatured、ゲル内の蛋白質を低下させて。伝統的なゲル ザイモグラフィーでゲルはブルーなどのタンパク質染料で染色、暗い青色の背景にすなわち、白いバンド (タンパク質の分解)、信号の損失としてプロテアーゼ活性を検出します。
ここでは、分解性基質、短い、共有組み込まれて電気泳動法 (図 1) 蛍光ペプチド ゲル ザイモグラフィー法が代替のプロトコルについて述べる。合成ペプチドの分解性基質としての置換伝統的なゲル ザイモグラフィー ネイティブ蛋白質9と比較してプロテアーゼの広い範囲の検出が有効に。蛍光ペプチドの共有結合連鎖ペプチド拡散とゲル電気泳動前メソッド9,10で観察中に移行を防止します。さらに、蛍光基板を使用する追加染色および染色解除手順なしプロテアーゼ活性の直接検出できます。このメソッドの全体的な目標は、共有のザイモグラムおよびゲルの蛍光ペプチド定款による生体試料中のプロテアーゼ活性の検出です。
Protocol
Representative Results
Discussion
におけるザイモグラムの現在の技術は、ネイティブ基板の蛋白の検出のためのポリアクリルアミドのゲルへの取り込みに依存します。これらの技術は広く使用いただいて中は、プロテアーゼを検出できる数でまだ限られました。ここでは、プロトコルは、どの蛍光灯、プロテアーゼ分解性ペプチドのポリアクリルアミド ゲルの解決に組み込まれている記述されていた。使用して結合共有結合…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オハイオ州大学大学工学、医用生体工学科、包括的がんセンター – アーサー g. ジェームス キャンサー ホスピタルとリチャード ・ j ・ ソロブ研究所によって提供される資金。
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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