Merkel celle Polyomavirus infektion og påvisning
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at inficere primære human dermal fibroblast med MCPyV. Protokollen omfatter isolering af dermal fibroblaster, udarbejdelse af MCPyV virioner, virusinfektion, immunofluorescens farvning og fluorescens i situ hybridisering. Denne protokol kan udvides til kendetegner MCPyV-værtssammenspil og opdage andre inficerbare celletyper ved MCPyV.
Abstract
Merkel celle polyomavirus (MCPyV) infektion kan føre til Merkel karcinom (MCC), en meget aggressiv form for hudkræft. Mekanistiske undersøgelser fuldt ud undersøge MCPyV Molekylærbiologi og muterede mekanismer har været hæmmet af en mangel på tilstrækkelige celle kultur modeller. Her, beskriver vi et sæt af protokoller for udførelse og afsløre MCPyV infektion af primære menneskelige hudceller. Protokollerne beskrive isolation af human dermal fibroblaster, forberedelse af rekombinante MCPyV virioner og påvisning af virusinfektion af både immunfluorescent (IF) farvning og in situ DNA-hybridisering kædereaktion (UNHCR), som er et meget følsomt Fluorescens i situ hybridisering (FISH) tilgang. Protokoller heri kan tilpasses af interesserede forskere til at identificere andre celletyper eller cellelinjer, der understøtter MCPyV infektion. Metoden beskrevet fisk kan også tilpasses til påvisning af lave niveauer af viral DNAs stede i den inficerede menneskelige hud.
Introduction
Merkel celle polyomavirus (MCPyV) er en lille, dobbelt-strenget DNA-virus, der har været forbundet med en sjælden men aggressiv hudkræft, Merkel celle karcinom (MCC)1,2. Dødeligheden af MCC, omkring 33%, overstiger værdien af melanom3,4. MCPyV har en cirkulær genom ~ 5 kb1,5 gennemskæres af en ikke-kodende regulerende region (NCRR) ind tidligt og sent kodende regioner1. NCRR indeholder replikation (Ori) og tovejs initiativtagere til viral transskription6,7viral oprindelse. Den tidlige region koder tumor antigen proteiner kaldet store T (LT), lille T (sT), 57kT, alternativ LT ORF (ALTO) samt en autoregulatory miRNA1,8,9,10. Den sene region koder kapsid proteiner VP1 og VP211,12,13. LT og sT er de bedst undersøgte proteiner, MCPyV og har været vist for viral DNA replikation og MCPyV-induceret tumordannelse5. Klonede integration af MCPyV DNA i vært genom, som er blevet observeret i op til 80% af MCC’er, er sandsynligvis en kausal faktor for virus-positiv tumor udvikling14,15.
Forekomsten af MCC er tredoblet over de sidste tyve år16. Asymptomatisk MCPyV-infektion er også udbredt i den almindelige befolkning17,18,19. Med det stigende antal MCC diagnoser og den høje prævalens af MCPyV infektion er der behov for at forbedre vores forståelse af virus og dens mutationer potentiale. Men mange aspekter af MCPyV biologi og muterede mekanismer fortsat dårligt forstået20. Dette er hovedsageligt fordi MCPyV replikater dårligt i etablerede celle linjer11,12,21,22,23 , og indtil for nylig, hud celler i stand til at støtte MCPyV infektion var ikke blevet opdaget22. Mekanistiske undersøgelser fuldt ud undersøge MCPyV og dens samspil med værtsceller har været hæmmet af en mangel på celle kultur system for formerings virus5.
Vi opdagede, at primære human dermal fibroblaster (HDFs) isoleret fra neonatal menneskelige forhuden støtte robust MCPyV infektion både in vitro- og ex vivo24. Fra denne undersøgelse etableret vi den første celle kultur infektion model for MCPyV24. Med udgangspunkt i denne modelsystem, viste vi at induktion af matrix metalloproteinase (MMP) gener af WNT/β-catenin signalering pathway og andre vækstfaktorer stimulerer MCPyV infektion. Desuden fandt vi, at FDA-godkendt MEK antagonist trametinib effektivt hæmmer MCPyV infektion5,25. Fra disse undersøgelser etableret vi også et sæt protokoller til isolering af human dermal fibroblaster24,25, forberede MCPyV virioner11,12, udføre MCPyV infektion af human dermal fibroblaster 24 , 25 og afsløre MCPyV proteiner af hvis farvning26. Derudover tilpasset vi den in situ DNA hybridisering kædereaktion (UNHCR) teknologi27 for at udvikle en meget følsomme fisk teknik (HCR-DNA fisk) til påvisning af MCPyV DNA i inficeret menneskers hudceller. Disse nye metoder vil være nyttige for at studere den smitsomme cyklus af MCPyV samt den cellulære reaktion på MCPyV infektion. De naturlige vært reservoir celler, der opretholder MCPyV infektion og de celler, der giver anledning til MCC tumorer forbliver ukendt. De teknikker, vi beskriver i dette manuskript kunne anvendes til at undersøge forskellige typer af humane celler til at identificere både reservoir-cellerne og oprindelsen af MCC tumorer. Vores etablerede metoder, som UNHCR-DNA fisk, kunne også være ansat i påvisning af andre DNA tumor vira og karakterisering af vært celle interaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder, der er beskrevet ovenfor, herunder isolering af dermal fibroblaster fra huden væv, forberedelse af rekombinante MCPyV virioner, infektion af dyrkede celler, immunfluorescent farvning og en følsomme fisk metode tilpasset fra UNHCR teknologi, som skal give forskerne til at analysere MCPyV infektion27. Et af de mest afgørende skridt til at opnå MCPyV infektion in vitro-er produktion af high-titer virion præparater. Ved hjælp af protokollen til forberedelse af rekombinante MCPyV viri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) og Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) for at give reagenser og teknisk support. Vi takker også medlemmerne af vores laboratorier for nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (R01CA187718, R01CA148768 og R01CA142723), NCI Cancer Center støtte Grant (NCI P30 CA016520) og Penn CFAR award (P30 AI 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
References
- Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
- Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
- Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
- Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
- Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
- Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
- Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
- Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
- Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
- Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
- Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
- Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
- Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
- Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
- Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
- Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
- Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
- Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
- Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
- Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
- Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
- Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
- Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)
