Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

默克尔细胞多瘤病毒感染与检测

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

在这里, 我们提出了一个方案, 以感染原生真皮成纤维细胞与 mcpyv。该方案包括皮肤成纤维细胞的分离、mcpyv 病毒的制备、病毒感染、免疫荧光染色和荧光原位杂交。该协议可以扩展到描述 mcpyv-主机相互作用的特征, 并发现 mcpyv 注入的其他细胞类型。

Abstract

默克尔细胞多瘤病毒 (mcpyv) 感染可导致默克尔细胞癌 (mcc), 这是一种极具攻击性的皮肤癌。由于缺乏适当的细胞培养模型, 充分研究 mcpyv 分子生物学和致癌机制的力学研究受到了阻碍。在这里, 我们描述了一组执行和检测人类皮肤细胞 mcpyv 感染的协议。这些协议描述了人真皮成纤维细胞的分离、重组 mcpyv 病毒的制备, 以及免疫荧光 (if) 染色和原位 dna 杂交链反应 (hcr) 检测病毒感染的方法, 这是一种高度敏感的方法。荧光原位杂交 (fish) 方法。有兴趣的研究人员可以对本文中的协议进行调整, 以确定支持 mcpyv 感染的其他细胞类型或细胞系。所描述的 fish 方法也可以用来检测受感染的人类皮肤中存在的低病毒 dna 水平。

Introduction

默克尔细胞多瘤病毒 (mcpyv) 是一种小型双链 dna 病毒, 与罕见但具有攻击性的皮肤癌, 默克尔细胞癌 (mcc)1,2。mcc 的死亡率, 约 33%, 超过黑色素瘤 3,4。mcpyv 的圆形基因组约为 5 kb 1,5 被非编码调控区 (ncrr) 一分为二, 进入早期和后期编码区域1。ncrr 包含病毒复制 (ori) 的病毒来源和病毒转录的双向启动子 6,7。早期区域编码肿瘤抗原蛋白称为大 t (lt), 小 t (st), 57kt, 替代 lt orf (alto), 以及自动调节 mirna1,8, 9, 10.后期区域编码衣壳蛋白 vp1 和 vp211,12,13。lt 和 st 是研究最多的 mcpyv 蛋白, 已被证明支持病毒 dna 复制和 mcpyv 诱导的肿瘤发生 5。mcpyv dna 在宿主基因组中的克隆整合, 在多达80% 的 mcc 中被观察到, 很可能是病毒阳性肿瘤发生 14,15的一个因果因素。

在过去20年中, mcc 的发病率增加了两倍16。无症状 mcpyv 感染在一般人群中也很普遍,为 17,18,19。随着 mcc 诊断数量的增加和 mcpyv 感染的高流行率, 有必要提高我们对病毒及其致癌潜力的认识。然而, mcpyv 生物学和致癌机制的许多方面仍然鲜为人知20。这主要是因为 mcpyv 在现有细胞系11、12、21、22、23以及直到最近的皮肤细胞中复制得很差, 直到最近, 还有能够支持 mcpyv 的皮肤细胞感染没有被发现 22。由于缺乏传播病毒的细胞培养系统, 充分研究 mcpyv 及其与宿主细胞相互作用的力学研究受到了阻碍。

我们发现, 从新生儿包皮中分离出的原代人真皮成纤维细胞 (hdf)在体外和体外24支持强大的 mcpyv 感染。通过本研究, 建立了 mcpyv24的第一个细胞培养感染模型。在该模型系统的基础上, 我们发现, 通过 wnt/β-儿茶素信号转导途径和其他生长因子诱导基质金属蛋白酶 (mmp) 基因刺激 mcpyv 感染。此外, 我们还发现, fda 批准的 mek 拮抗剂曲美替尼有效地抑制 mcpyv 感染5,25。通过这些研究, 我们还建立了一套隔离人真皮成纤维细胞 24,25的协议, 准备 mcpyv 病毒 11,12, 对人类真皮成纤维细胞进行 mcpyv 感染24,25和 mcpyv 蛋白的 if 染色26。此外, 我们还采用原位 dna 杂交链反应 (hcr) 技术27 , 开发了一种高度敏感的 fish 技术 (hcr-dna fish), 用于检测受感染的人类皮肤细胞中的 mcpyv dna。这些新方法将有助于研究 mcpyv 的感染周期以及细胞对 mcpyv 感染的反应。维持 mcpyv 感染的天然宿主水库细胞和引起 mcc 肿瘤的细胞仍然是未知的。我们在这篇手稿中描述的技术可以用来检查各种类型的人体细胞, 以确定储集细胞和 mcc 肿瘤的起源。我们已建立的方法, 如 hcr-dna fish, 也可用于检测其他 dna 肿瘤病毒和宿主细胞相互作用的特征。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

人类新生儿包皮是从宾州皮肤病研究中心获得的。成人人成纤维细胞是在手术后从废弃的正常皮肤中获得的。所有议定书都得到了宾夕法尼亚大学机构审查委员会的批准。

1. 人真皮成纤维细胞的分离

  1. 使用剪刀剪掉人类新生儿包皮的脂肪和皮下组织, 并将皮肤样本切成两半或四分之一。
  2. 在 pbs 中将 10 mgml 消解酶 ii 中的5毫升组织在4°c 后补充抗生素抗真菌。
  3. 在10厘米的无菌盘子里, 使用微解剖钳将表皮与真皮层仔细分离。
  4. 将产生的真皮组织转移到含有5毫升 2 mgml 胶原酶 iv 型的 15 ml 锥形管中, 在 fbs 不含源培养基中补充抗生素抗真菌药。
  5. 在37°c 的情况下将样品在 5% co2 中培养 4-6, 并有周期性晃动, 直到只保留几个宏观组织集体。
  6. 用10毫升的移液器, 通过上下移液 (三管) 大力释放单个细胞十次。
  7. 以 180 x g 离心 5分钟 , 并丢弃上清液。
  8. 在 5% co2 中, 在37°c 条件下, 在 dmem 培养基中培养离解细胞, 辅以10% 的胎儿小牛血清、1% 的非必需氨基酸和 1%的 l-谷氨酰胺。

2. 重组 mcpyv virion 制剂

  1. 以200μl 体积 (37°c 时 4小时) 的 250 u bahi-hf 消化50μg 的 pr17b 质粒 (携带 mcpyv 基因组), 将病毒基因组与病媒主干分离 (图 2)。
  2. 在消化的 dna 中加入1200μl 缓冲 pb (辅送10μl 的 3m naac, ph 5.2), 并通过2个微制备自旋柱 (20μg dna 容量) 进行纯化。用 200μl te 缓冲液 (10 mm tris-hcl, pR17b, 1 mm edta) 从每根柱中清除消化的 pr17b 质粒。
  3. 在50毫升离心管中准备结扎反应。从步骤2.2 中加入400μl 纯化质粒 dna, 将 1.05 x t4 连接酶缓冲液 8.6 ml 和高浓度 t4 连接酶6μl。在16°c 下隔夜孵化。
  4. 在结扎中加入45毫升缓冲 pb (辅以10μl 的 3m naac, ph 5.2), 并使用真空歧管通过2个微准备自旋柱加载。用 50μl te 缓冲液对每根柱进行洗脱。预计 dna 的产量约为30微克。
  5. 在傍晚, 种子 6 x10 6 293tt28细胞进入一个10厘米的盘子含有 dmem 培养基, 辅以10% 的胎儿小牛血清, 1% 非必需氨基酸, 1% l-谷氨酰胺没有湿霉素 b。
  6. 第二天早上, 确保细胞融合在 5 0% 左右。转染使用66微克升转染试剂 (1.1 微克 lcm2), 12 微克重组 mcpyv 分离 r17b dna 从步骤 2.4, 8.4 微克 st 表达质粒 pmtb 和9.6 微克 lt 表达质粒 padl *29。
  7. 当转染的细胞接近融合时, 第二天, 对细胞进行胰蛋白酶化, 并将其转移到 1 5 厘米的盘子中继续扩张。
  8. 可选在扩张时取少量293tt 细胞, 并对 mcpyv lt (cm2b4) 和 vp1 (mcv vp1 兔 30) 进行 if 染色, 以确定转染效率。在这个阶段, 核 lt 信号可能是可见的, 但 vp1 表达式可能无法检测到。
  9. 当15厘米的菜变成几乎融合 (通常5-6 后, 最初转染), 转移细胞成三个15厘米的菜。收获细胞从15厘米的菜肴时, 他们成为几乎融合, 并遵循下面的病毒收获协议。
    注: (可选) 执行质量控制 if, 如步骤2.8 中所述。在这一阶段, 大多数细胞应同时呈 mcpyv lt 和 vp1 阳性。
  10. 要收获病毒, 胰蛋白酶细胞, 在 rt 以 180 x g旋转 5分钟, 并去除上清液。加入一个细胞颗粒体积的 dpbs-mg (dbs 与 9.5 mm mgcl2和1x 抗生素-抗真菌)。然后加入 25 mm 硫酸铵 (从 1m ph 9k 库存溶液), 然后加入 0.5% triton x-100 (来自10% 的库存溶液)、0.1% 的苯并二酶和0.1% 的 atp 依赖 dnase。混合良好, 在37°c 孵育过夜。
  11. 将混合物在冰上加生量 15分钟, 然后加入0.17 体积的 5m ncl。在4°c 的离心机中, 在 12, 000 x 克的情况下, 在冰上再搅拌 15分钟, 旋转10分钟。如果上清液不清晰, 轻轻反转管, 重复纺纱步骤。将上清液转移到新管中。
  12. 如步骤2.11 所述, 使用一个容量的 dpbs 再加上 0.8 m 氯化钠, 然后再旋转。
  13. 将步骤2.11 和2.11 中的上清液结合起来, 再旋转一次, 如步骤2.11 中所述。
  14. 将碘沙诺梯度倒在薄壁5毫升多色管中, 采用底放 (27%, 然后 33%, 然后 39%) ~ 0.7 ml 步骤, 使用装有长针或 p1000 移液器的3毫升注射器。
  15. 在制备的碘化醇梯度上加载3毫升澄清含病毒上清液。
  16. 在 sw55ti 转子中旋转3.5 小时 , 温度为 2.4000 x g 和16°c。将加速和减速设置为慢速。
  17. 超离心后, 在硅化管中收集12个组分 (每个分数约 400μl)。
  18. 用 dsdna 试剂和/或西方印迹分析 vp1 (mcv vp1兔 30) 病毒存在的分数。池梯度分数与峰值 dsdna 和/或 vp1 含量, 并通过定量 pcr 表征股票, 以计算病毒基因组当量31。将 mcpyv 维瑞翁库存存放在-80°c。

3. 感染

  1. 在 dmem 中保持原代人真皮成纤维细胞, 有10% 的胎儿小牛血清、1% 的非必需氨基酸和1% 的 l-谷氨酰胺。到达合流处时, 分裂成纤维细胞 1: 4 而不向下旋转。
    注: 对于最高的 mcpyv 感染效率, 请使用在电镀时主动分裂的通道5和12之间的原生成纤维细胞。
  2. 感染人真皮成纤维细胞, 吸入培养基, 并用 dpbs 清洗细胞。
  3. 在盘中加入1毫升0.05% 的胰蛋白酶-edta, 在37°c 孵育5-10。
  4. 检查显微镜下, 以确保细胞从盘子里脱落。
  5. 加入含有 20 ngmml egf、20 ngml bfgf 和 3μm chr99021 的 dmm/f12 培养基的10毫升, 所有这些介质都刺激 mcpyv 感染24, 并将细胞溶液转移到 15 ml 管中。
  6. 将细胞向下旋转, 以 180 x g的速度旋转 2分钟, 并丢弃上清液。在 dmm/f12 培养基中, 在 2-4 x 10 4 细胞中, 将含有 20 ng/ml egf、20 ngml bfgf 和 3μm chr99021 的细胞重新移植。
  7. 种子200μl 的细胞悬浮液补充 1 mgml 胶原酶 iv 型到每口井的96孔板。解冻 mcpyv virion 股票在冰上。每 2, 500 至5000个细胞每1μl 碘沙诺添加 10 9个 mcpyv 维利昂病毒基因组等价物 (在步骤2.18 中计算)。 轻轻轻触板的一侧, 然后将板放在孵化器中。
  8. 在 5% co2 37°c 孵育 48-72小时后, 在每口井中加入20% 的 fbs。
  9. 允许感染在25°c 时在 5% co 2 中进行 72-96小时.

4. 免疫荧光染色

  1. 将步骤3.9 中获得的细胞与 pbs 中3% 的甲醛固定20分钟。
  2. 用 pbs 清洗细胞两次。
  3. 在 rt 中, 将细胞培养在块渗透缓冲液中 (0.5% triton x-100, 3% bsa 通过0.22μm 过滤器过滤1小时。
  4. 用以下原代抗体培养细胞: 小鼠单克隆抗 mcpyv lt (CM2B4) (1:1000) 和兔多克隆抗 anti-MCPyV vp1 抗体 (1:1000), 在 rt 3小时。
  5. 用 pbs 清洗细胞三次。
  6. 用二级抗体培养细胞: 氟594山羊抗小鼠 igg (1xy1000) 和 fluor 488 山羊抗兔 igg (1: 500) 在 rt 1小时。
  7. 用 pbs 清洗细胞三次。
  8. 用 0.5μgml dapi (4 ', 6-二胺-2-苯丁胺, 盐酸) 对细胞进行反染。
  9. 将盖板安装在玻璃幻灯片上, 并使用倒置荧光显微镜进行分析。

5. 就地 dna-hcr

注: 此技术要求在盖板上播种细胞。为此, 上述感染条件 (步骤 3) 可扩展到24井板格式。

  1. 用 4% pfa 在 pbs 中用 4% pfa 固定细胞 10分钟, 用 pbs 清洗两次盖板, 然后用70% 乙醇对其进行治疗, 使细胞在4°c 过夜时渗透。
    注: 固定示例可以在此状态下保留几天。
  2. 通过探针杂交缓冲液取代乙醇和在 rt 孵育 60分钟, 对乙醇进行预杂交。
  3. 在预杂交步骤结束前 30分钟, 在探针杂交缓冲液中稀释探针 (1:500) (表 1), 并在45°c 孵育。
  4. 在孵育结束时, 在显微镜幻灯片上, 每块布上的稀释探针混合的移液器 ~ 10μl。将盖板, 细胞侧向下, 在他们各自的杂交探针液滴混合。用少量的橡胶水泥将盖板的边缘和背面密封到滑梯上。
  5. 在94°c 时, 通过将滑块设置在热块的平面上, 将添加的探头加热3分钟。将滑块转移到加湿室, 并在45°c 下孵育过夜。为了使一个简单的加湿室, 轻轻抑制无菌纸巾与 dh2o 和放置在一个塑料容器的底部, 密封与橡胶垫片.
    注: 在加热过程中, 橡胶水泥可以短暂地起泡。但是, 请确保密封件不会破裂。
  6. 小心地剥去橡胶水泥用钳子, 并把盖板侧细胞侧回到一个24孔板的井。用探头清洗缓冲液在 rt 上清洗三次。
  7. 在 rt 30-60 内在放大缓冲液 (24 孔板中的 200μl) 中培养盖板。
  8. 同时, 退火两个标记的寡核苷酸发夹中的每一个通过加热到 94°c 90°c 和冷却到 rt 30分钟, 同时防止光线照射, 识别在单独的 pcr 管中的探针 (表 1)。将两个发夹混合在放大缓冲液中, 每个发夹稀释1:50。
  9. 通过将石蜡膜拉伸到24孔板盖的开口面上, 制作用于放大反应的表面。将发夹放大缓冲液混合物的液滴50-100μl 滴滴到石蜡膜上, 用于每个盖板。使用钳子小心地从预放大溶液中取出盖板。通过触摸边缘到多孔一次性擦拭, 擦干盖板, 并将细胞侧向下放置在放大液滴上。
  10. 将拿着盖板的盖板放在加湿的房间里, 在黑暗中在 rt 孵育一夜。
  11. 再一次把盖板还给井。用 5倍 ssct [5倍氯化钠 (ssc) 对样品进行过滤, 通过0.22μm 过滤器过滤 0.1% tween 20], 其中含有 0.5μgml dapi, 在 rt 用 5倍 ssct 清洗两次样品。
  12. 将盖板安装在显微镜幻灯片上。使用倒置荧光显微镜对细胞进行分析并对样品进行成像。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

本手稿中描述的协议允许隔离几乎同质的 hdf 群 (图 1)。免疫荧光染色显示, 使用本协议中描述的条件分离的人真皮细胞中, 几乎100% 的皮肤细胞对真皮成纤维细胞标记物、vimentin 和胶原蛋白 i24 进行了阳性染色, 但对人体呈阴性。包皮角质形成细胞标记 k14 (图 1)。图 2显示了使用重组 mcpyv 基因组和超离心浓缩后的 virions 样本生成 mcpyv 病毒的过程。在可视化了集中在梯度核心的 mcpyv 病毒带 (以图 2b中的箭头标记) 后, 采集了500μl 分数, 并进行了 mcpyv qpcr 识别峰值分数。qpcr 分析数据的一个示例如图2c所示。在其他一些实验中, 还使用兔抗 mcpyv vlp 抗体 (补充图 1), 用西方印迹对样本进行了分析。图 3显示了感染 mcpyv 的 hdf 的免疫荧光染色图像。为了手动量化阳性细胞, 我们统计了至少三个随机视图, 大约300个细胞。我们认为 lt 阳性、vp1 阳性或 lt 和 vp1 阳性的细胞对 mcpyv 感染呈阳性。在图 3所示的实验中, 超过30% 的细胞是 lt 阳性, 超过10% 的细胞是 vp1 阳性。使用 hcr-dna fish (图 4a) 和免疫荧光 hcr-dna (图4 b) 检测了在受感染细胞中复制的 mcpyv 基因组。虽然 hcr-dna fish 揭示了图4 a中复制厂 (焦点) 中 mcpyv dna 的定位, 但免疫荧光 hcr-dna 方法允许同时检测 mcpyv dna 和 lt 蛋白的共存定位(图 4b)。免疫荧光 hcr-dna fish 的图像表明, 这种技术可用于揭示病毒 dna 和相关病毒蛋白的共同定位。

Figure 1
图 1.从新生儿包皮中分离出的人真皮成纤维细胞.用抗 vimentin、胶原蛋白 i 或角蛋白 14 (k14) 的抗体染色在 dmm/f12 培养基中培养的人真皮细胞, 辅以 10% fbs。这些细胞也被 dapi 作了反染色。棒材, 50 微米。这一数字改编自刘等人的 图 s2 ,2016年 24.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.利用重组病毒基因组生产 mcpyv virion.(a) pr17b (mcpyv 基因组质粒) 的质粒图谱。(b) 在梯度上收获和纯化的 mcpyv virion 样品的代表性图片。箭头标记了集中在梯度核心的 mcpyv 维瑞昂带。(c) 用 qpcr 对每个梯度分数的病毒基因组拷贝数进行量化。核心梯度分数 (数字, 从梯度的顶部计算, 在图的底部显示)。错误条表示三次技术重复的平均值 (s. e. m.) 的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.人类真皮成纤维细胞支持强大的 mcpyv 感染、转录和复制.在含有 egf、bfgf、chr99021 和胶原酶 iv 的 dmem f12 培养基中, 用 mcpyv 维利子对从人体皮肤中分离出的皮肤成纤维细胞进行了两天的治疗。在改用含有 20% fbs 的新鲜 demm/f12 培养基三天后, 细胞使用指示的抗体进行免疫染色, 并用 dapi 进行反染色。许多细胞不仅具有高度表达的 lt 和 vp1, 而且还表现出强大的 mcpyv 复制焦点。这一数字改编自刘等人 2016年的图 3 24。刻度栏, 50 米. 请点击这里查看这个数字的一个更大的版本.

Figure 4
图 4.利用 fish 技术检测受感染细胞中的 mcpyv.(a) 用 mcpyv 治疗在 dmm任何 f12 中培养的含有 egf、bfgf、chr99021 和 iv 型胶原酶的人真皮细胞2天。在改用含有 fbs 的新鲜 dmmc/f12 后, 对这些细胞进行了 hcr-dna fish 分析。这些细胞也被 dapi 作了反染色。(b) 在含有 egf、bfgf 和 chr99021 的培养基中培养的人真皮细胞未经治疗 (moock) 或用 mcpyv 治疗 (感染), 如 (a) 所述。在使用 dapi 进行反染色之前, 对这些细胞进行了 lt 抗体和 mcpev 特异性 dna 探针的免疫 fish。hpv16 探针被用作负对照。刻度条, 10 米。这一数字改编自刘等人 2016年24 的图 4 。请点击这里查看此图的较大版本.

探头名称 序列
mcpyv 探头1 那是 tgaggttcattatttttttttttcctcttcttcttcttcttcttg attcttcttg attttctttcattttattctttattctttattcttthttp ttatttacctcatctccaccctacccccccccccccccccccccaccccccccccccccct
mcpyv 探头2 贸发合作的
mcpyv 探头3 那是以技术为目的
mcpyv 探头4 ccartccccccccccccccccccactctctctctctctctcactactaaa gatgttttttatttaagccttttcctcctcctcctcctcct attttct attttcct cattatccaccccccccccccccccccccccaccaccaccac
mcpyv 探头5 ccccartccccccccccccccactctctgctctctcta aaaa agcctttttagtagtagttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttcattcatcatcaccaccaccaccacccctccactcccccccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccccccaccaccaccccccccct
mcpyv 探头6 ccatccccccccccccactcctctctctctctcactcatgatgtattgatatcatccatccatccatccatcatcatcacacacaccaccattacaccacccccccccccaccaccac
mcpyv 探头7 那是一种重要的差距, 贸发会议的责任
mcpyv 探头8 贸发合作的
mcpyv 探头9 ccatccccccccccccccactctctctctctctc taaa agccatccatccatcttttgagggggggtc atttacacccacccccccccccacccacccacccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccac
mcpyv 探头10 ccccactccccccccccccactctctctctctctctctctctctaaaa tttgtgtgtgtttgtgtttttcgga ttattccactcatccaccccccccccccccccccccccccccccccccccct
hpv 探头1 ccccatccactccactctctctctctc taagctgtgtgttgtgtgttttttcc ttt cattacattacccccccccccccccccccac
hpv 探头2 ccatccactccccccccccactctctctctctctctcta. aaaa. atttcattcctcctcctcctcctcctccatcatcatcattcatcatcatcatcatcaccctaccccactccccccccaccaccaccaccaccaccac
hpv 探头3 taccacccccccccccccccccartctgctctctctctctcactactaaaa gtcagtattatgtagtagtagcactagccaccaccatttactacatttacccacccacccacccaccacccccccccccccccccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccccaccaccaccccccccccccccccccccccccccccaccacccccccccccccccccccccccccccccccccccccacccct
hpv 探头4 ccccartcccccccccccccccctctctctctctctctaaa tttttgtgggtgggcctaatatatt attttcatccacccaccccccccctacccacccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccaccaccccccccccaccactcac
hpv 探头5 ccat-ccatccccccccactcactctctctc taaaa ccattacatcccctcctcctccattccattccattccattccattcatcatcatcatcatcatcatccaccccccccccccccaccaccaccaccaccaccaccaccaccac

表 1: 研究中使用的探头。

Supplemental Figure 1
补充图1。筛选 mcpyv vp1 的碘沙诺梯度分数.对 mcpyv 感染细胞进行裂解, 并进行碘沙诺梯度分馏。对岩心梯度分数 (在本实验中从梯度底部计数的数字, 显示在图的顶部) 进行了西方印迹分析, 以检测 vp1。将每个组分的10μl 样品调整为1x 负载染料, 最终浓度为 2-硫醇 5%, 并短暂加热至65°c。样品在4-12 的双曲子凝胶上分离, 并涂抹在硝化纤维素上。采用兔抗 mcpyv vlp 抗血清稀释1:5000 在 tbst 中进行了西方印迹。抗血清可应要求提供。50 kda 标准 (类似于 47 kda mcpyv vp1 单体迁移) 用星号标记。在所示图像中, 样品还原不完整, 与双硫相连的 vp1 多聚体明显。使用二硫代三醇和/或更高的变性温度可以导致更完整地减少到 vp1 单体物种。请点击这里查看此图的较大版本.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

上述方法包括从人体皮肤组织中分离真皮成纤维细胞、制备重组 mcpyv 病毒、培养细胞感染、免疫荧光染色和采用 hcr 技术的敏感 fish 方法。应该使研究人员能够分析 mcpyv 感染 27.在体外实现 mcpyv 感染的最关键步骤之一是生产高滴度病毒制剂。利用本文所述的重组 mcpyv 病毒的制备方案, 我们实现了每毫升的 10, 12个基因组拷贝的病毒滴度, 共 11,12。这些高滴度 mcpyv 制剂使我们能够将 hdf 确定为迄今唯一一种似乎支持整个 mcpyv 感染周期24的原代皮肤细胞类型。

使用本手稿中描述的协议分离新鲜的人真皮成纤维细胞, 使我们能够控制 mcpyv 感染实验中使用的细胞的质量, 并确保从不同患者样本中分离出的细胞的结果的一致性。所有从新生儿皮肤中分离出的人真皮成纤维细胞都应通过 qpcr 评估是否存在 mcpyv dna, 以确保在使用重组 mcpyv virions 治疗之前没有 mcpyv 感染。为了获得最大的 mcpyv 感染效率, 关键是使用从新生儿包皮中新鲜分离的人真皮成纤维细胞, 因为较高通道的成纤维细胞支持较低的 mcpyv 感染效率。此外, 当与成人皮肤样本平行分离时, 新生儿皮肤样本中的成纤维细胞支持了更高的 mcpyv 感染效率24。我们从未检测过任何商业上可获得的细胞是否感染了 mcpyv。然而, 我们没有看到任何具体的原因, 商业孤立的成纤维细胞应该是劣质的, 除了如果他们是较高的通道在冰点。

我们还使用了这里描述的协议, 将皮肤成纤维细胞与其他动物隔离开来。例如, 我们使用该协议成功地从老鼠 (肌肉瘤)、老鼠 (诺韦吉克斯鼠)、树 (tucaiabelangeri) 和恒河猴 (macaque mulatta)25 中分离出皮肤成纤维细胞。正如在人类细胞中观察到的那样, 与年龄较大的动物25相比, 从年轻黑猩猩身上分离出的成纤维细胞允许更有效的 mcpyv 感染。

与传统的 fish 相比, hcr-dna fish 是检测病毒基因组24、27 的一种简单但高度敏感的方法。mcpyv 复制中心可以很容易地在受感染细胞的细胞核中检测为高度特异性的点状病灶, 在使用 hpv 特定探针处理的同一样本中几乎没有发现背景信号 (图 4)24。因此, 在未来, 可以探索这种方法来检测低丰度 mcpyv dna 存在于受感染的人类皮肤。它还可以用于监测其他 dna 病毒。当与免疫荧光染色相结合时, 免疫 fish 为同时检测病毒 dna 和病毒编码蛋白或同一细胞中的宿主蛋白提供了一种强大的方法 (图 4)。为了获得使用这里描述的协议的最佳结果, 最好使用新鲜固定的样本进行免疫荧光染色和 hcr-dna 分析。对于 hcr-dna 分析, 探针和放大器应存储在-80°c 的小等价物中, 以避免反复冻结和解冻。

利用 hdf 细胞培养和 mcpyv 感染协议, 我们探索了最支持 mcpyv 进入、转录和在 hdf 中复制的细胞生长条件。我们发现, 使用生长因子 (如 egf、bfgf) 治疗 hdf 和刺激 wnt 信号通路可显著促进 mcpyv 感染。基因表达谱显示, 在这些生长因子的刺激和 wnt 信号转导途径的激活下, 基质金属蛋白酶 (mmp) 家族的几个基因, 包括 mmp1、3、7、9、10、11和 13, 都得到了有力的诱导。因为这些 mmp 酶能够降解细胞外基质蛋白, 我们认为它们可能会通过破坏宿主细胞的细胞外基质来刺激 mcpyv 感染。事实上, 用 mmp 家族的成员--第四型胶原酶治疗 hdf, 可以有力地刺激 mcpyv 感染 (图 3)24。我们还筛选了一系列化合物, 包括几种 fda 批准的激酶抑制剂, 以达到对 mcpyv 感染的抑制作用。我们发现, 曲美替尼, 一种 mek1 和 mek2 抑制剂, 极大地抑制了 mcpyv 感染 24.其他人可能会使用或修改这种感染系统作为药物发现平台的 mcpyv 抑制剂, 减少 mcpyv 病毒负荷的免疫功能低下的患者。

总之, 这些实现高效 mcpyv 感染的方案提供了一个平台, 以阐明在病毒感染的情况下, mcpyv 感染周期和 mcpyv 诱导的致癌机制了解甚少。这一组协议可用于未来的研究, 以探索更多的 mcpyv 允许的人类细胞类型, 以及 mcc 的原始细胞, 其中偶然的 mcpyv 感染可能导致肿瘤的发展。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢 meenhard herlyn 博士 (wistar 研究所) 和 m. celeste simon 博士 (宾夕法尼亚大学) 提供试剂和技术支持。我们还感谢我们实验室的成员进行了有益的讨论。这项工作得到了国家卫生研究院 (r01ca187718、r01ca147778 和 R01CA187718)、nci 癌症中心支助赠款 (nci p30 c12016520) 和 penn cfar 奖 (p30 ai 045008) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

免疫学与感染 第144期 默克尔细胞多瘤病毒 隔离 真皮成纤维细胞 感染 胶原酶 iv 智利 99021 免疫荧光染色 荧光原位杂交 原位 dna 杂交链反应 转录复制
默克尔细胞多瘤病毒感染与检测
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter