Summary
여기, 우리는 프로토콜 기본 인간 피부 섬유 아 세포 MCPyV와 감염을 제시. 프로토콜은 제자리 교 잡에 피부 섬유 아 세포의 분리, MCPyV virions, 바이러스 감염, 면역 형광 염색 법, 형광의 준비를 포함 한다. 이 프로토콜은 MCPyV에 의해 특성화 MCPyV-호스트 상호 작용 및 다른 세포 유형 infectable을 발견에 대 한 확장할 수 있습니다.
Abstract
메르켈 세포 감염 폴리오 (MCPyV)는 메르켈 세포 암 종 (MCC), 매우 공격적인 형태의 피부 암으로 이어질 수 있습니다. 기계 연구 MCPyV 분자 생물학 및 종양 메커니즘을 완벽 하 게 조사를 적절 한 셀 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 우리가 수행 하 고 기본 인간 피부 세포의 MCPyV 감염 검출을 위한 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 프로토콜 immunofluorescent (IF) 얼룩이와 현장에서 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR), 매우 민감한은 인간 피부 섬유 아 세포의 고립 재조합 MCPyV virions의 준비 및 바이러스 감염의 탐지 설명 제자리 교 잡 (물고기) 접근에서의 형광 본 프로토콜 관심이 연구원은 다른 세포 유형 또는 MCPyV 감염을 지 원하는 셀 라인을 식별 하 여 적응 될 수 있다. 설명된 물고기 접근 감지 감염 된 인간 피부에 바이러스 성 DNAs의 낮은 수준에 대 한 또한 적응 수 있습니다.
Introduction
메르켈 세포 폴리오 (MCPyV)는 드물지만 적극적인 피부 암, 메르켈 세포 암 (MCC)1,2와 관련 된 작은, 이중 가닥 DNA 바이러스 이다. 고객 센터, 약 33%의 사망률의 흑색 종3,4를 초과합니다. MCPyV는1,~ 5 kb5 일찍 하 고 늦게 지역1코딩에 비 코딩 규제 지역 (NCRR)에 의해 bisected의 원형 게놈. NCRR 복제 (오 라), 바이러스 성 전사6,7에 대 한 양방향 발기인의 바이러스 성 기원을 포함 되어 있습니다. 초기 지역 대형 T (LT), 작은 T (sT), 57kT, 대체 LT ORF (알토), 뿐만 아니라 autoregulatory 미르1,8,,910라는 종양 항 원 단백질을 인코딩합니다. 늦은 지역 capsid 단백질 VP1, VP211,,1213인코딩합니다. LT와 세인트 베스트 공부 MCPyV 단백질은 바이러스 성 DNA 복제 및 MCPyV 유도 tumorigenesis5를 지원 하기 위해 표시 되었습니다. MCCs의 최대 80%에서 관찰 되었다, 주인 게놈으로 MCPyV DNA의 클론 통합 가능성이 바이러스 양성 종양 개발14,15에 대 한 원인 요소입니다.
고객 센터의 발생률은16지난 20 년 동안 3 배. 무 증상 MCPyV 감염 또한 일반 인구17,,1819에 대폭적 이다. 고객 센터 진단의 증가 수 및 MCPyV 감염의 높은 보급, 바이러스 그리고 종양 잠재력의 우리의 이해를 향상 시킬 필요가 있다. 그러나, MCPyV 생물학 및 종양 메커니즘의 여러 측면에 불완전 하 게 이해20남아 있다. 이것은 MCPyV 설립된 셀 라인11,12,21,,2223 에 가난 하 게 복제 하 고, 최근까지, 피부 세포 MCPyV를 지원 하기 때문에 크게 감염 된22되지 않았습니다 했다. 완전히 MCPyV 및 호스트 세포와의 상호 작용을 조사 하기 위해 기계 연구 전파 바이러스5셀 문화 시스템의 부족에 의해 방해 되어 있다.
우리는 기본 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFs) 신생아 인간의 포 지원 강력한 MCPyV 감염에서 모두 고립 생체 외에서 발견 및 비보 전24. 이 연구에서 우리는 MCPyV24에 대 한 첫 번째 셀 문화 감염 모델 설립. 이 모델 시스템을 기반으로, 우리는 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 유전자는 WNT/β-catenin 신호 통로 및 다른 성장 인자에 의해 유도 MCPyV 감염 자극 보였다. 또한, 우리는 FDA 승인 MEK 적 trametinib MCPyV 감염5,25을 효과적으로 억제 한다 발견. 이 연구에서 우리 또한 설립 인간 피부 섬유 아 세포24,25, 격리 하기 위한 프로토콜 집합 MCPyV virions11,12, MCPyV 감염 인간 피부 섬유 아 세포에 수행 준비 24 , 25 그리고 경우 얼룩26에 의해 감지 MCPyV 단백질. 또한, 우리는 원래의 DNA 교 잡 연쇄 반응 (HCR) 기술27 감염 된 인간 피부 세포에서 MCPyV DNA를 탐지 하기 위한 매우 중요 한 물고기 기술을 (HCR DNA 물고기)를 개발 하기 위해 적응. 이러한 새로운 방법을 MCPyV MCPyV 감염에 세포질 응답의 감염 주기를 공부 하는 데 유용 있을 것입니다. MCPyV 감염을 유지 하는 자연 호스트 저수지 셀 셀을 MCC 종양을 알 수 없는 남아 있습니다. 우리이 원고에서 설명 하는 기술은 다양 한 종류의 인간의 세포 저수지 셀을 식별 하 고 고객 센터 종양의 기원 검사에 적용할 수 있습니다. 우리의 설립된 방법, HCR DNA 생선, 다른 DNA 종양 바이러스의 검출에 호스트 세포 상호 작용의 특성 또한 채택 수 있습니다.
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Protocol
인간의 신생아 속하고 펜 피부 질환 연구 센터에서 얻은 했다. 성인 인간 섬유 아 세포는 수술 후 폐기 정상 피부에서 얻은 했다. 모든 프로토콜은 펜실베니아 기관 검토 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 인간 피부 섬유 아 세포의 고립
- 가 위를 사용 하 여 인간의 신생아 포 피에서 지방과 피하 조직에서 트림 하 고 반쪽 또는 분기 피부 샘플을 잘라.
- 10 mg/mL dispase PBS 항생제 antimycotic 보충에 II의 5 mL에 조직 품 어 4 ° C에서 하룻밤.
- 멸 균 10cm 접시에서 신중 하 게 서 집게를 사용 하 여 피부 층에서 표 피를 분리 합니다.
- 양도 2 mg/mL 콜라의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 결과 피부 조직 FBS 무료 매체 항생제 antimycotic 보충에 4를 입력.
- 그냥 몇 거시적인 조직 집계 남아 때까지 5% CO2 주기적인 동요를 가진 4-6 h 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- Pipetting (분쇄) 위아래로 적극적으로 10 배 10 mL 피 펫과 진 피에서 단일 셀을 분리 하십시오.
- 5 분, 180 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한.
- DMEM 매체 1%와 10% 태아 종 아리 혈 청, 1% 비 본질적인 아미노산, 보충에 천연된 셀 접시 5% CO2에서 37 ° C에서 L-글루타민.
2. 재조합 MCPyV virion 준비
- 250 (나르는 MCPyV 게놈) pR17b 플라스 미드의 다이제스트 50 µ g 200 µ L 볼륨 (37 ° C에서 4 h)에서 U의 BamHI-HF 벡터 백본 (그림 2)에서 바이러스 성 게놈을 분리.
- 소화 DNA에 버퍼 PB (10 µ L 3 M NaAc, pH 5.2의 보충)의 1200 µ L을 추가 하 고 2 miniprep 스핀 열 (20 µ g DNA 용량)를 정화. 200 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris HCl pH8.0, 1 mM EDTA)의 각 열에서 소화 pR17b 플라스 미드 elute
- 50 mL 원심 분리기 튜브에 결 찰 반응 준비. 단계 2.2, 1.05 x T4 리가 버퍼의 8.6 mL 및 높은 농도 T4 리가의 6 µ L에서에서 순화 된 플라스 미드 DNA의 400 µ L를 추가 합니다. 16 ° C에서 밤새 품 어.
- 결 찰에 버퍼 PB (10 µ L 3 M NaAc, pH 5.2의 보충)의 45 mL를 추가 하 고 진공 매니폴드 2 miniprep 스핀 열 로드를 사용 하 여. 각 열 테 버퍼의 50 µ L elute DNA의 약 30 µ g의 수익률을 기대 합니다.
- 늦은 오후/저녁, 10 ㎝로 씨앗 6 x 106 293TT28 셀 접시 1%와 10% 태아 종 아리 혈 청, 1% 비 본질적인 아미노산, 보충 포함 DMEM 매체 hygromycin B. 없이 L-글루타민
- 다음날 아침, 셀 약 50%는 확인 confluent. Transfection 시 약 (1.1 µ L/c m2)의 66 µ L를 사용 하 여 transfect, 다시 합자 MCPyV의 12 µ g 2.4, 세인트 식 플라스 미드 pMtB의 8.4 µ g와 9.6 µ g LT 식 플라스 미드 pADL *29의 단계에서 R17b DNA를 분리.
- Transfected 세포는 거의 confluent 다음 날, 셀 trypsinize 고 지속적인된 확장을 위한 15 cm 접시에 그들을 전송.
- 필요에 따라 확장 시 293TT 세포의 작은 수 고 MCPyV LT (CM2B4)에 대 한 얼룩 경우 수행 및 VP1 (MCV VP1 토끼30) transfection 효율을 결정 하. 이 단계에서 핵 LT 신호를 볼 수 있습니다 하지만 VP1 식 아마 되지 않습니다 감지.
- 15 cm 접시 때 거의 합칠 (보통 5-6 일 후 초기 transfection), 3 15 cm 요리에 셀을 전송. 그들은 거의 confluent 될 때 바이러스 수확 프로토콜을 아래에 따라 15 cm 요리에서 세포를 수확.
참고: 필요에 따라 단계 2.8에서에서 설명 하는 경우로 품질 관리를 수행 합니다. 세포의 대부분은 MCPyV LT와이 단계에서 긍정적인 VP1 이어야 한다. - 바이러스를 수확, 셀 trypsinize 하 고 RT에서 5 분 동안 180 x g 에서 스핀은 상쾌한을 제거 합니다. 한 셀 펠 릿 볼륨 DPBS Mg (9.5 m m MgCl2 와 1 x 항생제 antimycotic DPBS)의 추가. 다음 추가 25 m m (1 개 M pH 9 재고 솔루션)에서 황산 암모늄 뒤 0.5% 트라이 톤 X-100 (10% 주식 솔루션에서), ATP 의존 DNase의 0.1%와 0.1 %Benzonase. 잘 혼합 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 얼음에 15 분 동안 혼합물을 품 어 고 5 M NaCl의 0.17 볼륨을 추가 합니다. 믹스와 4 ° C 원심 분리기에서 12000 x g 에서 10 분에 대 한 또 다른 15 분 회전을 위해 얼음에 품 어. 상쾌한 명확 하지 않으면 부드럽게 튜브를 반전 하 고 회전 단계를 반복 합니다. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송.
- 단계 2.11에에서 설명 된 대로 다시 0.8 M NaCl와 스핀 보완 하는 DPBS의 한 볼륨을 사용 하 여 펠 릿 resuspend
- 2.11와 2.12, 단계에서 supernatants 결합 하 고 한 번 더 단계 2.11에에서 설명 된 대로 회전.
- 바탕 (27%, 다음 33%, 39%)에 의해 얇은 벽 5 mL polyallomer 튜브에 iodixanol의 그라디언트를 부 어 3 mL 주사기를 사용 하 여 ~0.7 mL 단계 긴 바늘 또는 p1000 피 펫 장착.
- 준비 된 iodixanol 그라데이션에 명확히 포함 하는 바이러스 상쾌한의 3 mL을 로드 합니다.
- 3.5 h 234000 x g 와 SW55ti로 터에서 16 ° C에 대 한 스핀. 가속 및 감속 속도를 설정 합니다.
- Ultracentrifugation, 후 시 튜브 (각 분수는 ~ 400 µ L) 12 분수를 수집 합니다.
- 바이러스의 존재에 대 한 분수 dsDNA 시 약 및/또는 VP1에 서쪽 오 점 분석 (MCV VP1 토끼30). 피크 dsDNA 또는 VP1 풀 그라데이션 분수 콘텐츠 그리고 양이 많은 PCR 바이러스 성 게놈에 해당31를 계산 하 여 재고 특성. -80 ° c.에 MCPyV virion 재고 저장
3입니다. 감염
- 유지 하는 기본 인간 피부 섬유 아 세포 DMEM에 1%와 10% 태아 종 아리 혈 청, 1% 비 본질적인 아미노산 L-글루타민. 합류에 도달, 분할 아래로 회전 없이 fibroblasts 1:4.
참고: MCPyV 감염 효율성을 사용 하 여 기본 fibroblasts 구절 5와 적극적으로 도금의 시간에 나누어 12 사이. - 인간 피부 섬유 아 세포, 감염 매체를 발음 하 고 세척 DPBS 셀.
- 0.05%의 1 mL을 추가 접시에 트립 신-EDTA와 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 셀 접시에서 오고 있다 다는 것을 확인 하는 현미경 검사.
- DMEM/F12 매체 포함 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF와 3 µ M의 10 mL를 추가할 CHIR99021, 모두는 MCPyV 감염24, 접시를 자극 하 고 15 mL 튜브에 셀 솔루션을 전송.
- 2 분, 180 x g 에서 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한. DMEM/F12 매체 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF와 3µM를 포함 하는 셀 resuspend CHIR99021 mL 당 104 셀 x 2-4.
- 보충 96 잘 접시의 각 음에 1 mg/mL 콜라 유형 IV 세포 현 탁 액의 200 µ L 씨 MCPyV virion 주식 얼음에 녹여 감염 된 것으로 각 2500 ~ 5000 셀에 대 한 iodixanol의 1 µ L 당 MCPyV virions (에서 계산된 단계 2.18)의 109 바이러스 성 게놈에 해당 추가 합니다. 접시의 사이드를 부드럽게 누르고 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 5% CO2 48-72 시간에서 37 ° C에 외피, 후 추가 20 %FBS 각 잘 하.
- 감염 5% CO2 72 96 시간에서 37 ° C에서 진행을 허용 합니다.
4. immunofluorescent 얼룩
- 20 분에 대 한 PBS에 3 %paraformaldehyde 단계 3.9에서에서 얻은 셀을 수정 합니다.
- PBS 가진 셀을 두 번 씻어.
- 차단/permeabilization 버퍼에 셀을 품 어 (0.5% 트라이 톤 X-100, PBS에 3% BSA 0.22 μ m 필터를 통해 필터링) 1 시간에 대 한 실시간에.
- 다음 주 항 체와 세포를 품 어: 마우스 단일 클로 널 안티-MCPyV LT (CM2B4) (1:1000)와 토끼 polyclonal 안티-MCPyV VP1 항 체 (1: 2000), 3 h에 대 한 실시간에.
- PBS 가진 셀 세 번 씻어.
- 2 차 항 체와 세포를 품 어: Fluor 594 염소 반대로 마우스 IgG (1:1000) 및 Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG (1: 500) RT에 1 시간.
- PBS와 셀 세 번 씻어.
- 0.5 µ g/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)와 셀 counterstain
- 유리에 마운트 coverslips 슬라이드 및 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 분석.
5. 현장에서 DNA-HCR
참고:이 기술은 coverslips에 셀 시드할 수 해야 합니다. 이 목적을 위해 (3 단계) 위에서 설명한 감염 조건 24-잘 플레이트 형식 조절 수 있습니다.
- 셀 수정 4 %coverslips 교양 PFA PBS로 두 번 10 분 워시는 coverslips에 대 한 PBS에 다음 취급 하룻밤 4 ° C에서 세포를 permeabilize을 70% 에탄올과.
참고: 고정 된 샘플 수 있는 몇 일 동안이 상태에 남아 있습니다. - 사전 조사 교 잡 버퍼와 에탄올을 대체 하 고 실시간에 60 분 동안 배양 하 여 샘플을 교배
- Probe(s) (1 µ M)를 희석 (표 1) 프로브 교 잡에서 1: 500 희석 30 분 사전 교 잡 단계 끝 이전에 솔루션을 버퍼링 하 고 45 ° c.에 품 어
- 외피는의 끝에, 현미경 슬라이드에 coverslip 당 희석된 프로브 믹스의 ~ 10 μ 플라스틱. 장소 coverslips, 셀-사이드, 교 잡 조사의 그들의 각각 방울 혼합. 가장자리와 고무 시멘트의 자유 금액으로 슬라이드에는 coverslips의 뒤를 봉인.
- 94 ° C에서 3 분에 대 한 추가 조사와 함께 열 블록의 편평한 측에 슬라이드를 설정 하 여 슬라이드를 열. 습도 챔버 슬라이드를 전송 하 고 하룻밤 45 ° C에서 품 어. 간단한 습도 챔버를 하려면 메 마른 종이 타 올 dH2O와 고무 가스 켓으로 밀봉 하는 플라스틱 컨테이너의 하단에서 약간 축이십시오.
참고: 고무 시멘트를가 열 하는 동안 수 거품 짧게. 그러나, 인감 휴식 하지 않습니다 확인 합니다. - 조심 스럽게 벗 겨 집게와 고무 시멘트 고 백업 coverslips 셀 사이드 24-잘 접시의 우물 합니다. 세 번 RT에서 프로브 워시 버퍼와 coverslips을 씻어.
- RT에서 증폭 버퍼 (24-잘 접시에서 200 µ L)에 coverslip 품 어 30-60 분.
- 한편, 두 개의 레이블된 oligonucleotide 헤어핀 90 94 ° C로가 열 하 여 별도 PCR 튜브에 프로브 (표 1)을 인식의 각 anneal s 고 빛 으로부터 보호 하면서 30 분에 대 한 RT를 냉각. 증폭 버퍼, 1시 50분의 희석에 각각 두 개의 헤어핀을 믹스.
- 24-잘 접시 뚜껑의 오픈 얼굴 파라핀 영화를 늘려서 증폭 반응에 대 한 화면을 확인 합니다. 50-100 µ L 방울 머리 핀/증폭 버퍼 혼합물 각 coverslip 파라핀 필름에의 플라스틱 집게를 사용 하 여 신중 하 게는 coverslips 사전 증폭 솔루션에서 제거. 다공성 일회용 없애 가장자리를 만져는 coverslip 건조 및 증폭 물방울에 아래로 셀 측을 두십시오.
- 습도 챔버에는 coverslips를 들고 접시 뚜껑을 배치 하 고 어둠 속에서 RT에서 밤새 품 어.
- 웰 스에 한 번 더는 coverslips를 반환 합니다. 5 샘플을 품 어 x SSCT [염화 나트륨 나트륨 시트르산 (SSC) 0.1% Tween 20 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 x 5] 샘플 5 두 번 씻어 0.5 µ g/l DAPI에서 실시간 1 h 포함 된 실시간에 x SSCT
- 현미경 슬라이드에는 coverslips를 탑재 합니다. 셀을 분석 하 고 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 샘플 이미지.
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Representative Results
이 원고에 설명 된 프로토콜 HDFs (그림 1)의 거의 균질 인구의 격리 허용. Immunofluorescent 얼룩에 의해 같이, 거의 100%는 인간의 피부 세포 격리를 사용 하 여이 프로토콜에서 설명 하는 조건을 했다 긍정적으로 스테인드 피부 섬유 마커, vimentin, 및 콜라겐 나24, 그러나 인간에 대 한 부정적인 포 피 keratinocyte 마커 K14 (그림 1). 그림 2 는 ultracentrifuge 농도 후 재조합 MCPyV 게놈 및 virion 샘플을 사용 하 여 MCPyV virions를 생성 하는 과정을 보여준다. 그라데이션 ( 그림 2B화살표에 의해 표시 된)의 핵심에 집중 하는 MCPyV virions의 밴드를 시각화, 후 500 µ L 분수 수집 그리고 MCPyV 정량 피크 분수를 식별 하기 위해 수행 되었다. 정량 분석 데이터의 예로 그림 2C에 표시 됩니다. 다른 실험에서 샘플도 토끼-안티-MCPyV VLP 항 체 (보충 그림 1)를 사용 하 여 서 부 럽으로 분석 되었다. 그림 3 HDFs MCPyV 감염의 immunofluorescent 스테인드 이미지를 보여준다. 수동으로 긍정적인 세포 계량, 우리는 약 300 셀의 적어도 3 개의 무작위 조회 계산. 우리 셀 LT 긍정적인, VP1 긍정적인, 또는 LT와 긍정적인 VP1 MCPyV 감염에 대 한 긍정적인 것을 고려 합니다. 그림 3에 표시 된 실험에서 이상 세포의 30%는 긍정적인 LT 고 10%는 VP1 긍정적인. 감염 된 세포에서 복제 MCPyV 유전자 HCR DNA 물고기(그림 4)와 Immunofluorescent-HCR-DNA 물고기 (그림 4B)를 사용 하 여 발견 했다. HCR DNA 물고기 보여준다 MCPyV DNA 복제 공장 (포커스) 그림 4A에 있는의 현지화, Immunofluorescent-HCR-DNA 물고기 방법 있습니다 MCPyV DNA와 LT 단백질 공동 지역화의 동시 검출을 복제에서 (그림 4B) 센터. HCR DNA immunofluorescent 물고기에서 이미지가이 기술은 바이러스 성 DNA와 관련 된 바이러스 성 단백질의 공동 지역화를 나타내기 위해 사용 될 수 보여 줍니다.
그림 1 . 신생아 인간의 포 피에서 고립 된 인간 피부 섬유 아 세포. 10% FBS vimentin에 대하여 항 체를 사용 하 여 스테인드 했다 보충 DMEM/F12 매체에 경작 하는 인간의 피부 세포 콜라겐, 또는 케 라틴 (K14) 14. 셀도 DAPI와 counterstained 했다. 바, 50 µ m입니다. 이 그림에서 그림 S2 리 우 외., 201624의 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 재조합 형 바이러스 성 게놈을 사용 하 여 MCPyV virion의 생산. PR17b의 (A) A 플라스 미드 맵 (MCPyV 게놈 플라스 미드). (B) A MCPyV virion 샘플 사진의 대표 수확 하 고 그라디언트를 통해 정화. 화살표는 그라데이션의 핵심에 집중 하는 MCPyV virions의 밴드를 표시 합니다. 각 그라데이션 분수에서 (C) 바이러스 성 게놈 복사본 수 정량 Pcr를 사용 하 여 정량 했다. 코어 그라데이션 분수 (숫자, 그라데이션, 위에서 계산 그래프의 맨 아래에 표시 됩니다). 오차 막대는 3 개의 기술 반복의 의미 (S.E.M.)의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 인간 피부 섬유 아 세포는 강력한 MCPyV 감염, 전사, 및 복제 지원. 인간의 피부에서 분리 된 피부 섬유 아 세포는 이틀 동안 DMEM F12 매체 포함 된 EGF, bFGF, CHIR99021, 그리고 콜라 4에서 MCPyV virions로 대우 되었다. 20%를 포함 하는 신선한 DMEM/F12 매체를 변경한 후 FBS 3 더 많은 일에 대 한 세포 면역-표시 된 항 체를 사용 하 여 얼룩진 되었고 DAPI와 counterstained. 세포의 많은 LT, VP1 표명한 매우 뿐만 아니라 강력한 MCPyV 복제 foci 표시. 이 그림은 그림 3 의 리 우 외., 201624에서 적응 했다. 바, 50 미터 규모 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 물고기 기술을 사용 하 여 감염 된 세포에서 MCPyV의 검출. (A) 인간의 피부 세포 DMEM/F12 EGF, bFGF, CHIR99021, 그리고 콜라 유형 IV는 2 일 동안 MCPyV로 치료 했다 포함 된에서 경작. 변경한 후 신선한 DMEM/f 12 3 더 일 FBS를 포함, 셀 HCR DNA 물고기 분석 대상이 되었다. 셀도 DAPI와 counterstained 했다. (B) 인간 피부 세포에서 중간 포함 된 EGF, bFGF, 경작 하 고 CHIR99021 어느 치료 (모의) 또는 (A)에 설명 된 대로 MCPyV로 (감염)을 치료. 세포 면역-물고기를 복종 되었다 DAPI와 counterstaining 전에 항 체 및 MCPyV 관련 DNA 프로브 LT를 사용 하 여. HPV16 프로브 부정적인 제어로 사용 되었다. 스케일 바, 10 m입니다. 이 그림은 그림 4 의 리 우 외., 201624에서 적응 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 프로브 이름 | 시퀀스 |
| MCPyV 프로브 1 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 프로브 2 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 조사 3 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 프로브 4 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 프로브 5 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 프로브 6 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 프로브 7 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 조사 8 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 조사 9 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| MCPyV 조사 10 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| HPV 프로브 1 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| HPV 프로브 2 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| HPV 조사 3 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| HPV 프로브 4 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
| HPV 프로브 5 | CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC |
표 1: 조사 연구에 사용 합니다.
보충 그림 1입니다. Iodixanol 그라데이션 분수 MCPyV VP1 심사. MCPyV에 감염 된 세포 lysed 했다 Iodixanol 그라데이션 분별 법에 복종 하 고. 코어 그라데이션 분수 (숫자,이 실험에서 그라데이션 아래에서 세는 그림의 상단에 표시 됩니다) VP1 감지 하 서쪽 오 점 분석을 복종 되었다. 각 분수의 10 µ L 샘플 2-mercaptoethanol의 5% 최종 농도와 부하 염료 x 1로 조정 하 고 짧게 65 ° c.에가 열 했다 샘플 4-12% 두번째-트리 스 젤에서 분리 되었고 니트로에 얼룩이. 서 부 럽 토끼-안티-MCPyV VLP 원으로 희석 1: 5000을 사용 하 여 탈지 건조 우유 TBST에 실시 되었다. 고 원으로 요청 시 가능 합니다. 50 kDa 표준 (47 kDa MCPyV VP1 단위체에 유사 하 게 마이그레이션합니다)는 별표와 함께 표시 됩니다. 표시 된 이미지에서 샘플 감소 완료 되었고 이황화 연결 VP1 multimers 분명 있습니다. Dithiothreitol 변성 고온의 사용 VP1 단위체 종에 더 완전 한 감소 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
인간의 피부 조직에서 피부 섬유 아 세포의 분리, 재조합 MCPyV virions의 준비, 배양된 세포, immunofluorescent 얼룩이 지 고 HCR 기술에서 적응 하는 민감한 물고기 방법의 감염을 포함 하 여, 위에서 설명한 방법입니다 MCPyV 감염27를 분석 하는 연구원을 사용 해야 합니다. 생체 외에서 MCPyV 감염을 달성 하는 가장 중요 한 단계 중 하나는 높은 titer virion 준비의 생산 이다. 여기에 설명 된 재조합 MCPyV virions의 준비에 대 한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 idoxanol 용 매11,12의 mL 당 1012 게놈 사본의 바이러스 titers를 얻을. 이러한 높은 titer MCPyV 준비 우리가 주 피부 세포 유형으로 지금까지 HDFs를 식별 하기 위해 전체 MCPyV 감염을 지원 하기 위해 나타나는24주기.
신선한 인간의 피부 섬유 아 세포가이 원고에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 격리 활성화 우리 MCPyV 감염에 사용 되는 셀의 품질 실험 및 다른 환자 샘플에서 고립 된 셀에서 결과의 일관성을 보장 하는 제어. 모든 인간 피부 섬유 아 세포 신생아 피부에서 고립 재조합 MCPyV virions 치료 전에 MCPyV 감염의 부재를 보장 하기 위해 정량에 의해 MCPyV DNA의 존재에 대 한 평가 해야 합니다. 최대 MCPyV 감염 효율을 얻기 위해서는 높은 통로 fibroblasts 낮은 MCPyV 감염 효율성 지원 신생아 인간의 포 피에서 갓 고립 된 인간 피부 섬유 아 세포를 사용 하 여 중요 하다. 또한, 성인 피부 샘플에서 병렬에서 절연, 신생아 피부 샘플에서 fibroblasts 훨씬 더 높은 감염 MCPyV 효율성24지원. 결코 MCPyV 감염에 대 한 상용 셀 테스트 했습니다. 그러나, 우리는 상업적으로 섬유 아 세포를 절연 구체적인 이유가 해야 열 등 이외의 경우 동결 시점에서 높은 통행을 참조 하십시오.
우리는 또한 다른 동물에서 피부 섬유 아 세포를 격리 하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 고. 예를 들어 우리는 익숙해 프로토콜 성공적으로 마우스 (생쥐), 쥐 (Rattus norvegicus), 나무 잔소리 꾼 (Tupaia Belangeri), 그리고 붉은 털 원숭이 (Macaca mulatta)25에서 피부 섬유 아 세포를 분리. 인간 세포에서 관찰, fibroblasts 젊은 침팬지에서 분리 이전 동물25에 비해 훨씬 더 효율적인 MCPyV 감염을 허용.
전통적인 물고기에 비해, HCR DNA 물고기 간단, 하지만 바이러스 성 게놈24,27을 탐지 하기 위한 매우 중요 한 방법 이다. MCPyV 복제의 센터 HPV 특정 조사 (그림 4)24로 치료 같은 샘플에서 발견 배경 신호를 거의 매우 구체적인 punctate foci로 감염 된 세포의 핵에서 쉽게 검색 수 있습니다. 미래에, 접근 따라서 낮은 풍부 MCPyV DNA에 감염 된 사람의 피부를 감지 하 탐험 수 있습니다. 그것은 또한 다른 DNA 바이러스 모니터링을 적용할 수 있습니다. Immunofluorescent 얼룩과 결합 될 때 면역-물고기 바이러스 DNA 바이러스 인코딩된 단백질 및 호스트 단백질 같은 셀 (그림 4)에 동시에 검출 하는 강력한 방법을 제공 합니다. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 최적의 결과 얻기위한 것이 immunofluorescent 얼룩이 지 고 HCR DNA 물고기 분석에 대 한 갓 고정된 샘플을 사용 하 여 좋습니다. HCR DNA 물고기 분석에 대 한 프로브와 증폭기 반복 중지 및 재개를 피하기 위해 작은 aliquots에-80 ° C에 저장 되어야 합니다.
HDF 세포 배양 및 MCPyV 감염 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 가장 잘 HDFs에 MCPyV 항목, 전사, 및 복제를 지 원하는 셀 성장 조건 탐험. 우리 EGF, bFGF, 및 WNT 신호 통로의 자극 크게 홍보 MCPyV 감염과 같은 성장 요인의 HDFs 그 치료를 발견 했다. 진 식 프로 파일링, 이러한 성장 요인 및 WNT 신호 통로의 활성화 자극, 시 매트릭스 metalloproteinase (MMP) 가족, 3, 7, 9, 10, 11, 13, MMP1 등의 여러 가지 유전자 유도 견고 했다 보여준다. 이러한 MMP 효소 기질 단백질을 타락 할 수 있기 때문에, 우리는 그들이 호스트 세포의 기질을 방해 하 여 MCPyV 감염을 자극 수 있습니다 이유. 실제로, 콜라 종류 IV HDFs를 치료, MMP 제품군은 튼튼하게 MCPyV 감염 (그림 3)24자극. 우리는 또한 MCPyV 감염에 억제 효과 대 한 몇 가지 FDA 승인 kinase 억제제를 포함 한 화합물의 배열을 상영. 우리는 trametinib 발견 MEK1 및 MEK2 억제제는 극적으로 MCPyV 감염24를 억제. 다른 사용 하거나 immunocompromised 환자에서 MCPyV 바이러스 부하를 줄일 수 MCPyV 억제제 약물 검색 플랫폼으로이 감염 시스템을 수정할 수 있습니다.
요약 하자면, 고효율 MCPyV 감염을 달성 하기 위한 이러한 프로토콜 제대로 명료 하 플랫폼 이해 MCPyV 감염 주기 및 바이러스 성 감염의 맥락에서 MCPyV-유도 종양 메커니즘 제공 합니다. 프로토콜의이 세트는 추가 MCPyV 허용 인간 세포 유형 및 MCC, 감염 종양 개발에 이어질 수 있는 부수적 MCPyV에서에서의 원래 세포 탐험 미래 연구에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 박사 Meenhard Herlyn (Wistar 연구소)과 박사 M. 셀 레스트 사이먼 (펜실베니아 대학교) 시 약 및 기술 지원 제공 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 유용한 토론에 대 한 우리의 실험실의 구성원 감사. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) 보조금 (R01CA187718, R01CA148768 및 R01CA142723), NCI 암 센터 지원 그랜트 (NCI P30 CA016520), 그리고 펜 CFAR 수상 (P30 AI 045008)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
References
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