Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Merkel celle Polyomavirus infeksjon og gjenkjenning

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å infisere primære menneskelige dermal fibroblast med MCPyV. Protokollen inneholder isolering av dermal fibroblaster, utarbeidelse av MCPyV virions, virusinfeksjon, immunofluorescence flekker og fluorescens i situ hybridisering. Denne protokollen kan utvides for karakteriserer MCPyV vert interaksjoner og oppdage andre celletyper infectable ved MCPyV.

Abstract

Merkel celle polyomavirus (MCPyV) infeksjon kan føre til Merkel celle carcinoma (MCC), en svært aggressiv form for hudkreft. Mekanistisk studier til fullt undersøke MCPyV molekylærbiologi og kreftfremkallende mekanismer har vært hemmet av mangel på tilstrekkelig celle kultur modeller. Her beskriver vi et sett med protokoller for utføring og oppdage MCPyV infeksjon av primære menneskelig hudceller. Protokollene beskrive isolering av menneskelig dermal fibroblaster, utarbeidelse av rekombinant MCPyV virions og påvisning av virusinfeksjon av både immunofluorescent (hvis) flekker og i situ DNA-hybridisering kjedereaksjon (HCR), som er et fluorescens i situ hybridisering (fisk) tilnærming. Protokollene her kan tilpasses av interessert forskere å identifisere andre celletyper eller linjer som støtter MCPyV infeksjon. Beskrevet fisk tilnærming kan også tilpasses til å oppdage lave nivåer av viral DNAs i den infiserte menneskelige huden.

Introduction

Merkel celle polyomavirus (MCPyV) er en liten, double-strandet DNA virus som er tilknyttet en sjelden, men aggressiv hudkreft, Merkel celle carcinoma (MCC)1,2. Dødeligheten av MCC, rundt 33%, overstiger det av melanom3,4. MCPyV har en sirkulær genomet ~ 5 kb1,5 delt i to av en ikke-kodingen regulatoriske region (NCRR) i tidlig og sent koding regioner1. NCRR inneholder viral opprinnelsen til replikering (Ori) og toveis arrangører for viral transkripsjon6,7. Tidlig regionen koder svulst antigen proteiner kalt store T (LT), liten T (sT), 57kT, alternativ LT ORF (ALTO), samt en autoregulatory miRNA1,8,9,10. Sen regionen koder kapsid proteiner VP1 og VP211,12,13. LT og sT er de best studerte MCPyV proteinene og har vist seg å støtte viral DNA-replikasjon og MCPyV-indusert tumorigenesis5. Klonal integrering av MCPyV DNA i vert Genova, som har blitt observert i opptil 80% av MCCs, er sannsynligvis en årsakssammenheng faktor for virus-positive svulst utvikling14,15.

Forekomsten av MCC har tredoblet over de siste tyve år16. Asymptomatisk MCPyV infeksjon er også utbredt i befolkningen generelt17,18,19. Med det økende antallet MCC diagnoser og den høye utbredelsen av MCPyV infeksjon er det behov for å forbedre vår forståelse av viruset og dets kreftfremkallende potensial. Mange aspekter av MCPyV biologi og kreftfremkallende mekanismer beholdes imidlertid dårlig forstått20. Dette er hovedsakelig fordi MCPyV replikerer dårlig i etablerte cellen linjer11,12,21,22,23 , og inntil nylig hudceller støtter MCPyV infeksjon hadde ikke blitt oppdaget22. Mekanistisk studier å fullt undersøke MCPyV og dets interaksjon med verten cellene har vært hemmet av mangel på celle kultur-systemet for å spre virus5.

Vi oppdaget at primære menneskelig dermal fibroblaster (HDFs) isolert fra neonatal menneskelige foreskin støtte robust MCPyV infeksjon både i vitro og ex vivo24. Fra denne studien etablerte vi den første celle kultur infeksjon modellen MCPyV24. Bygge på denne modellen systemet, viste vi at induksjon av matrise metalloproteinase (MMP) gener av WNT/β-catenin signalering veien og andre vekstfaktorer stimulerer MCPyV infeksjon. Videre fant vi at FDA-godkjent MEK antagonist trametinib effektivt hemmer MCPyV infeksjon5,25. Fra disse studiene har etablert vi også et sett med protokoller for å isolere menneskelig dermal fibroblaster24,25, forbereder MCPyV virions11,12, utfører MCPyV infeksjon på menneskelig dermal fibroblaster 24 , 25 og oppdage MCPyV proteiner av hvis flekker26. Dessuten, tilpasset vi de i situ DNA hybridisering kjedereaksjon (HCR) teknologi27 for å utvikle en svært følsom fisk teknikk (HCR-DNA fisk) for å oppdage MCPyV DNA i infiserte menneskelig hudceller. Disse ny metoder vil være nyttig for å studere smittsomme syklusen MCPyV samt i cellulær respons til MCPyV infeksjon. Naturlig vert reservoaret cellene som opprettholder MCPyV infeksjon og cellene som gir opphav til MCC svulster forblir ukjent. Teknikkene vi beskriver i dette manuskriptet kan brukes for å undersøke ulike typer menneskelige celler å identifisere både reservoaret cellene og opprinnelsen til MCC svulster. Vårt etablerte metoder, for eksempel HCR-DNA fisk, kan også brukes i deteksjon av andre DNA svulst virus og karakterisering av verten celle interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige Nyfødte forhuder ble innhentet fra Penn hud sykdom Research Center. Voksen menneskelig fibroblaster var oppnådd fra forkastet normal hud etter operasjonen. Alle protokollene ble godkjent av University of Pennsylvania institusjonelle Review Board.

1. isolering av menneskelig dermal fibroblaster

  1. Bruke et par saks til å klippe av fett og underhud vev fra menneskelige Nyfødte foreskin og kuttet huden prøven i halve eller kvarte.
  2. Inkuber vevet i 5 mL 10 mg/mL dispase II i PBS med antibiotika-antimycotic på 4 ° C over natten.
  3. I et sterilt 10 cm rett, nøye separat overhuden fra dermal lag med microdissection tang.
  4. Overføre den resulterende dermal vev en 15 mL konisk rør som inneholder 5 mL av 2 mg/mL collagenase type IV i FBS-fri medium med antibiotika-antimycotic.
  5. Inkuber prøven på 37 ° C i 5% CO2 for 4-6 h med periodisk risting gjenstår kun makroskopisk vev aggregat.
  6. Slipp enkeltceller fra dermis av pipettering opp og ned (triturating) kraftig ti ganger med en 10 mL pipette.
  7. Sentrifuge 180 x g i 5 min, og forkaste nedbryting.
  8. Plate dissosiert cellene i DMEM medium med 10% fosterets kalv serum, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% L-glutamin ved 37 ° C i 5% CO2.

2. rekombinant MCPyV virion forberedelse

  1. Digest 50 µg av pR17b plasmider (bærer MCPyV genomet) med 250 U av BamHI HF i et 200 µL volum (4 h på 37 ° C) skille er viral genomet fra vektor ryggraden (figur 2).
  2. Legge til 1200 µL av buffer PB (supplert med 10 µL av 3 M NaAc, pH 5.2) fordøyd DNA og rense over 2 miniprep spinn kolonner (20 µg DNA kapasitet). Elute fordøyd pR17b plasmider fra hver kolonne med 200 µL av TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Forberede ligation reaksjonen i en 50 mL sentrifuge rør. Legge til 400 µL av renset plasmider DNA fra trinn 2.2, 8.6 mL 1.05 x T4 ligase buffer og 6 µL av høy konsentrasjon T4 ligase. Ruge på 16 ° C over natten.
  4. Legger til 45 mL bufferen PB (supplert med 10 µL av 3 M NaAc, pH 5.2) ligation og bruker en vakuum manifold laste gjennom 2 miniprep spinn kolonner. Elute hver kolonne med 50 µL TE bufferen. Forvente en avkastning på om lag 30 µg DNA.
  5. I sen ettermiddag/kveld, frø 6 x 106 293TT28 cellene i en 10 cm rett som inneholder DMEM medium med 10% fosterets kalv serum, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% L-glutamin uten hygromycin B.
  6. Neste morgen, kontroller at cellene er ca 50% confluent. Transfect bruker 66 µL av transfection reagensen (1.1 µL/cm2), 12 µg av nytt samskrevet MCPyV isolere R17b DNA fra trinn 2.4, 8.4 µg av ST uttrykk plasmider pMtB og 9,6 µg LT uttrykk plasmider PADI *29.
  7. Når de transfekterte cellene er nesten confluent, dagen, trypsinize cellene og overføre dem til en 15 cm rett for fortsatt ekspansjon.
  8. Eventuelt ta et lite antall 293TT celler ved utvidelse og utføre hvis flekker for MCPyV LT (CM2B4) og VP1 (MCV VP1 kanin30) å avgjøre hva effektivitet. På dette stadiet, kjernefysiske LT signalet kan være synlig men VP1 uttrykk sannsynligvis vil ikke være synlig.
  9. Når 15 cm parabolen blir nesten confluent (vanligvis 5-6 dager etter første transfection), overføre cellene i tre 15 cm retter. Høste celler fra 15 cm rettene når de blir nesten confluent og følger virus harvest protokollen nedenfor.
    Merk: Du kan også utføre kvalitetskontroll hvis som beskrevet i trinn 2.8. De fleste cellene skal være både MCPyV LT og VP1 positivt på dette stadiet.
  10. For å høste viruset, trypsinize celler, spinn på 180 x g i 5 min på RT og fjerne nedbryting. Legge til én celle pellet volum av DPBS-Mg (DPBS med 9,5 mM MgCl2 og 1 x antibiotika-antimycotic). Legg deretter til 25 mM ammonium sulfate (fra en 1 M pH 9 lagerløsning) etterfulgt av 0,5% Triton X-100 (fra en 10% lagerløsning), 0,1% Benzonase og 0,1% av en ATP-avhengige DNase. Bland godt og ruge på 37 ° C over natten.
  11. Inkuber blandingen i 15 min på is og legger 0,17 volum på 5 M NaCl. Bland og ruge på is en annen 15 min. spinn på 10 min 12 000 x g i en 4 ° C sentrifuge. Hvis nedbryting ikke er klart, forsiktig Inverter røret og gjenta trinnet spinning. Overføre nedbryting til en ny tube.
  12. Resuspend pellets bruker ett volum for DPBS supplert med 0,8 M NaCl og spinn igjen, som beskrevet i trinn 2.11.
  13. Kombiner supernatants fra trinn 2.11 og 2.12, og spinner en gang som beskrevet i trinn 2.11.
  14. Hell graderinger av iodixanol i tynn vegg 5 mL polyallomer rør av underliggende (27%, og 33%, så 39%) ~0.7 mL skritt benytter en 3 mL sprøyte utstyrt med en lang nål eller en p1000 pipette.
  15. Laste inn 3 mL avklart virus inneholder nedbryting på forberedt iodixanol graderingen.
  16. Spinne 3,5 h 234,000 x g og 16 ° C i en SW55ti rotoren. Angi akselerasjon og deselerasjon å avta.
  17. Etter ultracentrifugation, samle 12 brøker i silikoniserte rør (hver fraksjon er ~ 400 µL).
  18. Analysere fraksjoner etter virus ved dsDNA reagens og/eller Western blot for VP1 (MCV VP1 kanin30). Bassenget gradient brøker med topp dsDNA og/eller VP1 innhold og karakterisere aksjer av kvantitative PCR beregne viral genomet tilsvarende31. Lagre MCPyV virion lager i-80 ° C.

3. infeksjon

  1. Opprettholde primære menneskelig dermal fibroblaster i DMEM med 10% fosterets kalv serum, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% L-glutamin. Ved å nå samløpet, delt fibroblaster 1:4 uten spinne ned.
    Merk: Den største MCPyV infeksjon effektiviteten bruke primære fibroblaster mellom passasjer 5 og 12 som er aktivt dele ved plating.
  2. For å infisere human dermal fibroblaster, Sug opp mediet og vask cellene med DPBS.
  3. Legge 1 mL av 0,05% Trypsin-EDTA til retten og Inkuber på 37 ° C i 5-10 min.
  4. Sjekk under mikroskop for å sørge for at cellene kommer av parabolen.
  5. Legge til 10 mL av DMEM/F12 medium som inneholder 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF og 3 µM CHIR99021, som stimulerer MCPyV infeksjon24, til retten og overføre celle løsningen i en 15 mL tube.
  6. Nedspinning cellene på 180 x g i 2 minutter, og forkaste nedbryting. Resuspend cellene i DMEM/F12 medium som inneholder 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF og 3µM CHIR99021 på 2-4 x 104 celler per mL.
  7. Frø 200 µL av cellen suspensjon med 1 mg/mL collagenase type IV i hver brønn en 96-brønns plate. Tine MCPyV virion lager på is. Legge til 109 viral genomet ekvivalenter av MCPyV virions (beregnet i trinn 2,18) per 1 µL av iodixanol for hver 2500 til å 5000 celler er infisert.   Trykker på siden av tallerkenen forsiktig og Plasser platen i inkubator.
  8. Etter inkubasjon på 37 ° C i 5% CO2 for 48-72 h, legge til 20% FBS i hver brønn.
  9. Tillate infeksjonen fortsette på 37 ° C i 5% CO2 72-96 h.

4. immunofluorescent flekker

  1. Fastsette celler hentet i trinn 3.9 med 3% paraformaldehyde i PBS for 20 min.
  2. Vask cellene med PBS to ganger.
  3. Inkuber cellene i blokkering/permeabilization buffer (0,5% Triton X-100, 3% BSA i PBS filtrert gjennom 0.22 µm filter) på RT 1t.
  4. Inkuber cellene med følgende primære antistoffer: mus monoklonale anti-MCPyV LT (CM2B4) (1:1000) og kanin polyklonale anti-MCPyV VP1 antistoff (1:2000), på RT 3 h.
  5. Vask cellene med PBS tre ganger.
  6. Inkuber cellene med sekundær antistoffer: Fluor 594 geit anti-musen IgG (1:1000) og Fluor 488 geit anti-kanin IgG (1:500) på RT 1t.
  7. Vask celler med PBS tre ganger.
  8. Counterstain cellene med 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride).
  9. Mount coverslips på glass lysbilder og analysere bruker en invertert fluorescens mikroskop.

5. In situ DNA-HCR

Merk: Denne teknikken krever at celler bli sådd på coverslips. For dette formålet, kan infeksjon forholdene beskrevet ovenfor (trinn 3) skaleres til 24-vel plate format.

  1. Fastsette celler kultivert på coverslips med 4% PFA i PBS for 10 min. vask coverslips to ganger med PBS, deretter behandle dem med 70% etanol permeabilize cellene på 4 ° C over natten.
    Merk: Fast prøver kan forbli i tilstanden i flere dager.
  2. Pre hybridize eksempler ved å erstatte etanol med sonde hybridisering buffer og rugende for 60 min på RT.
  3. Fortynn probe(s) (1 µM) (tabell 1) i sonde hybridisering buffer løsning på 1:500 fortynning 30 min før pre hybridisering trinnet og Inkuber på 45 ° C.
  4. På slutten av incubations, Pipetter ~ 10 μL utvannet sonde mix per dekkglassvæske på objektglass. Sted coverslips, celle-side ned, på sine respektive dråper av hybridisering sonde blande. Forsegle kantene og ryggen av coverslips på lysbildene med en liberal gummi sement.
  5. Varme lysbildene med ekstra sonder på 94 ° C i 3 minutter ved å angi lysbildene på den flate siden av en varme blokk. Overføre lysbilder til en fuktet kammer og ruge på 45 ° C over natten. For å gjøre en enkel fuktet kammer, fukt sterilt papirhåndklær med dH2O og sted i bunnen av en plast beholderen som tetter med en Gummipakning.
    Merk: Under oppvarming gummi sement kan boble kort. Men sørge for at forseglingen ikke bryte.
  6. Nøye skrelle bort gummi sement med tang og plasser den coverslips celle-siden opp igjen i brønner av en 24-vel plate. Vask coverslips med sonde vaskebuffer på RT tre ganger.
  7. Inkuber dekkglassvæske i forsterkning bufferen (200 µL i 24-vel plater) på RT 30-60 minutter.
  8. I mellomtiden anneal hver av de to merket oligonucleotide hårnåler gjenkjenne sonder (tabell 1) i separate PCR rør ved oppvarming 94 ° c for 90 s og kjøling til RT 30 min samtidig beskytte mot lyset. Bland de to hårnåler forsterkning buffer, hver på en fortynning av 1:50.
  9. Gjøre en overflate for forsterkning reaksjonen ved å strekke parafin film over åpne ansiktet til 24-vel plate lokk. Pipetter 50-100 µL dråper av hårnål/forsterkning buffer blandingen på parafin filmen for hver dekkglassvæske. Bruk tang nøye fjerne coverslips fra før forsterkning løsning. Tørke av dekkglassvæske ved å berøre kanten en porøs disponibel tørk og plasser celle-side ned på forsterkning slippverktøyet.
  10. Plasser platen lokket holder coverslips i en fuktet kammer og ruge over natten på RT i mørket.
  11. Tilbake til coverslips brønner igjen. Inkuber prøvene med 5 x SSCT [5 x natriumklorid natriumsitrat (SSC) 0,1% mellom 20 filtrert gjennom filtere 0.22 µm] inneholder 0,5 µg/mL DAPI 1t på RT. vaske prøvene to ganger med 5 x SSCT på RT.
  12. Montere coverslips på objektglass. Analysere cellene og image eksemplene bruker en invertert fluorescens mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet i dette manuskriptet tillatt isolering av nesten homogen innbyggere HDFs (figur 1). Som vist av immunofluorescent flekker, farget nesten 100% av den menneskelige dermal celler isolert bruke forholdene beskrevet i denne protokollen var positivt for dermal fibroblast markører, vimentin og kollagen jeg24, men negativ for menneskelige foreskin keratinocyte markør K14 (figur 1). Figur 2 viser prosessen med å generere MCPyV virions bruke rekombinante genom MCPyV og en virion sample etter ultracentrifuge konsentrasjon. 500 µL fraksjoner samlet inn etter visualisere av MCPyV virions konsentrert i kjernen av gradient (merket med en pil i figur 2B), og MCPyV qPCR ble utført for å identifisere toppen fraksjoner. Et eksempel på qPCR analyse dataene vises i figur 2C. I noen andre eksperimenter, var prøvene også analysert med vestlige blotting bruker en kanin-anti-MCPyV VLP antistoff (supplerende figur 1). Figur 3 viser immunofluorescent farget bilder av HDFs infisert med MCPyV. For å manuelt kvantifisere positiv celler, regnet vi minst tre tilfeldige utsikt over 300 celler. Vi anser celler som LT positiv VP1 positivt, eller både LT og VP1 positivt å være positivt for MCPyV infeksjon. I eksperimentene vises i Figur 3, 30% av celler er over LT positiv og mer enn 10% er VP1 positive. MCPyV genomer replikert i de infiserte cellene ble oppdaget hjelp av HCR-DNA fisk (Figur 4A) og Immunofluorescent-HCR-DNA fisk (Figur 4B). Mens HCR-DNA FISKEN avslører lokaliseringen av MCPyV DNA i replikering fabrikken (fokus) i Figur 4A, Immunofluorescent-HCR-DNA fisk metodene tillater samtidig deteksjon av både MCPyV DNA og LT protein co lokalisere ved replikering sentrerer (Figur 4B). Bilder fra immunofluorescent-HCR-DNA FISKEN vist at denne teknikken kan brukes å avsløre co lokalisering av virus-DNA og tilhørende viral protein.

Figure 1
Figur 1 . Menneskelig dermal fibroblaster isolert fra neonatal menneskelige foreskin. Menneskelige dermal celler kultivert i DMEM/F12 medium med 10% FBS var farget med antistoffer mot vimentin, collagen jeg, eller keratin 14 (K14). Cellene ble også counterstained med DAPI. Bar, 50 µm. Dette tallet ble tilpasset fra Figur S2 av Liu et al., 201624. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Produksjon av MCPyV virion bruker rekombinant viral genomet. (A) A plasmider kart over pR17b (MCPyV genomet plasmider). (B) en representant bilde av en MCPyV virion prøve høstes og renset over gradering. Pilen markerer av MCPyV virions konsentrert i kjernen av graderingen. (C) viral genomet kopien nummer i hver forløpning fraksjon ble kvantifisert ved hjelp av qPCR. Core gradient fraksjoner (tall, teller fra toppen av gradient, indikeres nederst i diagrammet). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (S.E.M.) av tre tekniske gjentakelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Menneskelig dermal fibroblaster støtte robust MCPyV-infeksjon, transkripsjon og replikering. Dermal fibroblaster isolert fra menneskelig hud ble behandlet med MCPyV virions i DMEM F12 middels inneholder EGF, bFGF, CHIR99021 og collagenase IV i to dager. Etter bytte til frisk DMEM/F12 medium som inneholder 20% FBS for tre dager, celler var immuno-farget med angitte antistoffer og counterstained med DAPI. Mange av cellene ikke bare uttrykt svært LT og VP1 men også vise robust MCPyV replikering foci. Dette tallet var tilpasset fra Figur 3 av Liu et al., 201624. Skalere bar, 50 m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Deteksjon av MCPyV i infiserte celler med fisk teknikker. (A) menneskelige dermal celler kultivert i DMEM/F12 som inneholder EGF, bFGF, CHIR99021 og collagenase type IV ble behandlet med MCPyV i 2 dager. Etter bytte til frisk DMEM/F12 som inneholder FBS for 3 dager, ble cellene utsatt for HCR-DNA fisk analyse. Cellene ble også counterstained med DAPI. (B) menneskelige dermal celler kultivert i middels inneholder EGF, bFGF, og CHIR99021 var enten ubehandlet (falske) eller behandlet (infisert) med MCPyV som beskrevet i (A). Cellene ble utsatt for immuno-fisk ved hjelp av < antistoff og MCPyV-spesifikke DNA sonder før counterstaining med DAPI. HPV16 sonder ble brukt som en negativ kontroll. Skala bar, 10 m. Dette tallet var tilpasset fra Figur 4 av Liu et al., 201624. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sonden navn Sekvenser
MCPyV sonde 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabell 1: Sonder brukes i studien.

Supplemental Figure 1
Ekstra figur 1. Screening Iodixanol gradient brøker for MCPyV VP1. MCPyV-infiserte celler var lysed og utsatt for Iodixanol gradert fraksjoneres. Kjernen gradient fraksjoner (tall, teller fra bunnen av graderingen i dette eksperimentet, angis øverst i figuren) ble utsatt for Western blot analyse VP1. 10 µL prøver av hver fraksjon var justert til 1 x Last fargestoff med en 5% siste konsentrasjon av 2-mercaptoethanol og kort oppvarmet til 65 ° C. Prøvene var atskilt på en 4-12% bis-Tris gel og strøket på nitrocellulose. Vestlige blotting ble gjennomført i TBST med tørr melk nonfat bruker en kanin-anti-MCPyV VLP antiserum fortynnet 1:5000. Antiserum er tilgjengelig på forespørsel. Den 50 kDa standard (som overfører tilsvarende til den 47 kDa MCPyV VP1 monomer) er merket med en stjerne. I vises bildet, prøve reduksjon var ufullstendig og disulfide knyttet VP1 multimers vises. Bruk av dithiothreitol og/eller rødsprit temperaturer kan føre mer komplett reduksjon VP1 monomer arter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som er beskrevet ovenfor, inkludert isolering av dermal fibroblaster fra huden vev, utarbeidelse av rekombinant MCPyV virions, infeksjon i kulturperler celler, immunofluorescent flekker og følsom fisk metode tilpasset fra HCR teknologi, som bør aktivere forskere til å analysere MCPyV infeksjon27. En av de viktigste trinnene å oppnå MCPyV infeksjon i vitro er produksjon av høy-titer virion forberedelser. Bruker protokollen for utarbeidelse av rekombinant MCPyV-virions beskrevet her, oppnå vi viral titers 1012 genomet eksemplarer per mL idoxanol løsemiddel11,12. Disse høy-titer MCPyV forberedelser tillatt oss å identifisere HDFs som bare primære hud celle hittil til støtte full MCPyV infeksjon syklus24.

Isolere friske menneskelige dermal fibroblaster ved hjelp av protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet har gitt oss å kontrollere kvaliteten på cellene som brukes i MCPyV infeksjon eksperimentere og sikre konsekvens av funnene i celler isolert fra forskjellige pasientprøvene. Alle menneskelige dermal fibroblaster isolert fra neonatal hud bør vurderes for tilstedeværelse av MCPyV DNA av qPCR å sikre fravær av MCPyV infeksjon før behandling med rekombinant MCPyV virions. For å oppnå maksimal MCPyV infeksjon effektivitet, er det viktig å bruke menneskelig dermal fibroblaster isolert fersk fra neonatal menneskelige foreskin høyere passasje fibroblaster støtte lavere MCPyV infeksjon effektivitet. Videre, når isolert parallelt fra voksen hud prøver, fibroblaster fra neonatal hud prøver støttes mye høyere MCPyV infeksjon effektivitet24. Vi har aldri testet kommersielt tilgjengelig celler for MCPyV infeksjon. Vi ser imidlertid ingen spesiell grunn som kommersielt isolert fibroblaster bør være dårligere enn hvis de er høyere passasje på frysing.

Vi har også brukt protokollen beskrevet her for å isolere dermal fibroblaster fra andre dyr. Vi har for eksempel brukt protokollen vellykket isolere dermal fibroblaster fra mouse (Mus musculus), rotten (Rattus norvegicus), Trefurie (Tupaia Belangeri) og rhesus macaque (Macaca mulatta)25. Som observert i menneskeceller, tillatt fibroblaster isolert fra yngre sjimpanser mye mer effektiv MCPyV infeksjon i forhold til de eldre dyr25.

Sammenlignet med tradisjonelle fisk, er HCR-DNA fisk en enkel, men svært følsom metode for påvisning av viral genomer24,27. Sentre for MCPyV replikering kan lett oppdaget i kjerner i infiserte celler som svært spesifikke vises punctate foci, med liten eller ingen bakgrunn signal i samme prøvene behandlet med en HPV bestemt sonde (Figur 4)24. I fremtiden, kan tilnærming derfor bli undersøkt for å oppdage lav-overflod MCPyV DNA i infiserte menneskelig hud. Det kan også tilpasses til å overvåke andre DNA virus. Kombinert med immunofluorescent flekker, gir immuno-fisk en kraftig metode for å samtidig oppdage virus-DNA og viral kodet protein eller vert proteiner tilstede i de samme cellene (Figur 4). For å oppnå optimale resultater ved hjelp av protokoller som beskrevet her, er det best å bruke fersk fast eksempler for immunofluorescent flekk og HCR-DNA fisk analyse. For HCR-DNA fisk analyse, bør sonder og forsterker lagres i-80 ° C i små dele å unngå gjentatt frysing og tining.

Bruke HDF cellekultur og MCPyV infeksjon protokollen, utforsket vi celle vekst vilkårene som best støtter MCPyV oppføring, transkripsjon og replikering i HDFs. Vi oppdaget at behandling av HDFs med vekst faktorer, slik som EGF, bFGF og stimulering av WNT signalveien betydelig fremme MCPyV infeksjon. Gene expression profilering avslører at ved stimulering med disse vekstfaktorer og aktivering av WNT signalveien, flere gener av matrise metalloproteinase (MMP) familien, inkludert MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 og 13, robust ble indusert. Fordi disse MMP enzymer er nedverdigende ekstracellulær matrix proteiner, grunn vi at de kan stimulere MCPyV infeksjon ved å forstyrre den ekstracellulære matrisen verten cellene. Faktisk stimulerer behandle HDFs med collagenase type IV, medlem av MMP familien, robust MCPyV infeksjon (Figur 3)24. Vi har også vist en rekke stoffer, inkludert flere FDA-godkjent kinase hemmere, for hemmende effekt på MCPyV infeksjon. Vi oppdaget at trametinib, en MEK1 og MEK2 inhibitor, dramatisk hemmer MCPyV infeksjon24. Andre kan bruke eller endre denne infeksjon system som narkotika funnet plattform for MCPyV hemmere som reduserer MCPyV viral belastning i immunsupprimerte pasienter.

Oppsummert gir disse protokollene for å oppnå svært effektiv MCPyV infeksjon en plattform for å belyse dårlig forstått MCPyV smittsomme syklus og MCPyV-indusert kreftfremkallende mekanismer i sammenheng med viral infeksjon. Dette settet med protokoller kan brukes i fremtidige studier å utforske flere MCPyV-ettergivende menneskelige celletyper, og de opprinnelige cellene av MCC, i hvilken tilfeldige MCPyV infeksjon kan føre til tumor utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) og Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) for å gi reagenser og teknisk støtte. Vi takker også medlemmene i våre laboratorier for nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd (R01CA187718, R01CA148768 og R01CA142723), NCI Cancer Center støtte Grant (NCI P30 CA016520) og Penn CFAR prisen (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 144 Merkel celle polyomavirus isolasjon dermal fibroblaster infeksjon collagenase IV CHIR99021 immunofluorescent flekk fluorescens i situ hybridisering i situ DNA-hybridisering kjedereaksjon transkripsjon replikering
Merkel celle Polyomavirus infeksjon og gjenkjenning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter