레이저에서 고품질 RNA 격리 스테인리스 프로토콜 캡처 Microdissected Purkinje 세포 인간의 사후 소 뇌에

Summary

이 프로토콜 얼룩 없는 접근을 사용 하 여 시각화 하 고 레이저 캡처 서 통해 인간의 사후 뇌에서 신선한-냉동 조직에서 Purkinje 세포를 분리. 이 프로토콜의 목적은 RNA 시퀀싱에 대 한 높은-품질 RNA의 충분 한 양을 생성 하는 것입니다.

Abstract

레이저 캡처 기정 (LCM) cytologically 또는 phenotypically 관련 셀 또는 이기종 조직에서 영역에 대 한 수 있는 유리한 도구입니다. 캡처된 사용할 수 있습니다 다양 한 단백질, 분자 방법에에서 DNA 또는 RNA 격리. 그러나, 인간의 사후 뇌 조직에서 RNA의 보존은 특히 도전적 이다. LCM에 대 한 표준 시각화 기술을 더 또는 추가 수 immunohistochemical 얼룩 절차 RNA 저하 됩니다. 따라서, 우리는 사후 뇌 조직에서 RNA 무결성을 보존 하기의 용도와 LCM에 시각화를 위한 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 소 뇌의 Purkinje 세포 크기 및 특성 위치 스테인리스 시각화에 대 한 좋은 후보입니다. 소 뇌 피 질의 세포 밀도, 그들 고배율 현미경에서 식별 하는 좋은 상을 만드는 다른 독특한 레이어 있다. Purkinje 세포는 큰 신경 작은 신경의 밀도가 셀룰러 네트워크는과 립 세포 레이어 및 셀 시체에 스파스는 분자 층 사이 위치. 이 건축 때문에 스테인레스 시각화의 사용은 가능 합니다. 이 표현 형을 모방 하는 다른 기관 또는 셀 시스템도 적합 한 것입니다. 에탄올과 신선한 냉동 조직 수정 하 고 높은 확대 가벼운 현미경 검사 법에서 향상 된 형태학 시각화를 위한 크 실 렌과 지질 제거 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 이 프로토콜 다른 고정 방법을 고려 하지 않습니다 하 고 자외선 (UV)를 사용 하 여 캡처한 신선한 냉동 조직 샘플에 대 한 특별히 설계 된-LCM 시스템. 여기, 선물이 단면화 및 후속 RNA 시퀀싱에 대 한 RNA 품질을 유지 하면서 UV LCM에 의해 분리 하는 Purkinje 세포에서 신선한 냉동된 사후 인간 소 뇌 조직 및 RNA의 정화를 해결에 대 한 전체 프로토콜. 우리의 손에이 프로토콜 착 색 시 약을 위한 필요 없이 세포 시각화의 뛰어난 수준을 생산 하 고 transcriptional 프로 파일링 실험에 대 한 필요에 따라 높은 RNA 무결성 번호 (≥8)와 RNA를 생성 합니다.

Introduction

레이저 캡처 기정 (LCM)는 후속 분자로 제어 평가 대 한 병 적 관련 세포의 분리 수 있습니다 귀중 한 연구 도구입니다. 이러한 다른 유형의 조직 표본 및 병리학 및 임상 데이터와 상관 관계에 분자 분석의 사용 생물 학적 연구¹의 변환의 평가에 필요한 단계입니다. RNA 유전자 표현 데이터를 분석할 때 언된 조직 단면도의 사용이 좋습니다 RNA의 우수한 품질에 대 한 수 뿐 아니라 수량²최대화. 그것은 잘 설립 되었습니다 높은 품질과 수량 RNA의 RNA 시퀀싱³에서 의미 있는 데이터에 대 한 필수적입니다. 그러나, LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 조직에서 RNA를 사용 하 여 때 RNA 강 직은 주요 도전, 죽음에 즉시 발생 하 고 그 범위는 조직의 컬렉션 방법^{4,5와 관련 된 다양 한 요인에 의해 중재} . 또한, RNA 저하 얼룩 기법 인식 더 세부 사항 및 셀 식별 하는 데 필요한 때 악화 됩니다. 전문 기술 되며 & 오신, Nissl 얼룩, 얼룩 면역 형광 및 immunohistochemistry 주변 기질에서 세포를 차별화 하는 데 도움이 하지만 RNA 저하 고 사본 식 변경 표시 되었습니다. 프로필⁶. 따라서, 우리의 실험실 스테인리스 프로토콜 Purkinje 신경의 LCM 격리 후 RNA 시퀀싱의 목적에 대 한 사후 인간 소 뇌에 RNA를 보존 하기 위해 특별히 만들었습니다.

LCM에 대 한 신선한 냉동된 조직 처리, 고정 방법 변함없이 RNA와 조직의 무결성을 발생할 수 있습니다. 포 르 말린 고정 형태 보존을 위한 표준 이지만 원인 있는 cross-linking RNA 수 있습니다 그리고 RNA 증폭⁷방해. 그것은 상호¹을 유도 하지 않는 coagulative 정착 액 에탄올 고정 RNA 격리에 대 한 더 나은 대안입니다. 조직 형태학의 시각화를 향상 시키기 위해, 크 실 렌은 조직에서 지질 제거로 최고의 선택 이다. 그러나, 조직 수 밖으로 건조 하 고 레이저 캡처⁷시 취 일으키는 조직 조각화 되 LCM, 자일 렌을 활용 하면 제한 알려져 있습니다. 크 실 렌은 또한 휘발성 독 소 하 고 증기 두건에서 제대로 처리 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 크 실 렌은 또한 RNA 무결성⁸을 유지 하면서 조직 시각화를 향상을 보였다. 따라서, 우리의 프로토콜 70% 에탄올 고정 및 에탄올 탈수, 크 실 렌 외피 형태학 선명도 대 한 다음의 사용 주위 센터.

그것은 그들은 속도, 정밀도, 및 RNA 품질 표시 되었습니다로 서 레이저 기반 시스템의 종류를 주의 하는 것이 중요. 적외선 (IR) 레이저 캡쳐 서 자외선 (UV) 레이저 microbeam 기정 시스템⁸을 거의 동시에 등장 하는 두 소설 LCM 플랫폼을 했다. IR-LCM 시스템 사용 조직 섹션에 투명 열가 소성 필름을 사용 하 여 “연락처 시스템” 그리고 관심사의 세포 선택적으로 준수 영화 집중된 펄스에 의해 IR 레이저에서. 또는, UV LCM 시스템은 세포 또는 조직;에 대 한 관심의 영역이 그것에 의하여 초점된 레이저 빔을 멀리 인하 “비 접촉 시스템” 거꾸로 또는 똑바로 현미경 디자인 중 하나를 사용 하는 두 현재 사용 가능한 상용 플랫폼에서 구성에 따라 조직 중력에 대 한 투 석기는 레이저 유도 압력 파에 의해 수집 장치로 인수 또는 조직 중력에 의해 각각 수집. UV LCM 시스템의 중요 한 장점 빠른 세포 수집, 비 접촉 방식 및 많은 더 작은 레이저 빔 직경⁹인 더 정확한 해 부 오염 무료 컬렉션을 포함합니다. 이 프로토콜은 UV LCM 시스템을 위해 설계 된 고 IR LCM 시스템에서 테스트 되지 않았습니다. 어느 UV LCM 시스템 설계에 컬렉션 모자에 축적 셀는 coverslip의 사용을 향상 하는 때 현미경 중 세포 선명도가 아니다 적합, 셀 컬렉션 모자에 입력 수 없습니다. 따라서, 조직 시각화를 향상 시키기 위해, 액체 채워진된 컬렉션 모자에 대 한 UV LCM 시스템에 미세한 시각화 coverslip로 행동 하도록 설계 된 불투명 컬렉션 모자를 사용 하 여 테스트 했습니다. 액체는 증발 하 고 현미경에서 작업 하는 동안 자주 교체 해야 합니다 액체 채워진된 컬렉션 모자, 도전적 일 수 있다. 캡처된 조직을 녹이 고 즉시⁷시간 RNA 안정성에 대 한 중요 한 요소가 된다.

우리의 실험실 연구 진전 (동부)을 가진 환자의 소 뇌 및 소 뇌의 신경 관련된 질환에 사후 neuropathologic 변경 합니다. 우리는 시연 대 컨트롤, Purkinje 세포의 감소 된 수를 포함 하 여 동부 표준시 경우를 구별 하는 Purkinje 셀에 중심 형태 론 적 변화 증가 수지상 회귀 및 axonal 변화의 다양 한 공준을 선도 그 Purkinje 세포 변성은 외 병^10,11,,1213에 핵심 생물 학적 기능입니다. Transcriptional 프로 파일링은 세포 퇴행 성 변화의 기본 분자 단위로 탐구에 많은 신경학 상 질병에 사용 되었습니다. 그러나, 뇌 조직 영역 같은 다른 유형의 샘플에서 transcriptional 프로필 수 effectually 낮은 풍부 성적 표현의 마스크 또는 감소의 영향을 받는 작은 인구에서 서만 발생 하는 분자 변화 감지 소 뇌 피 질에서 Purkinje 세포와 같은 세포. 예를 들어, Purkinje 세포는 훨씬 숫 적 소 뇌 피 질에 풍부한과 립 세포에 의해 약 1:3000; 따라서, 효과적으로 대상에 자신의 transcriptome 이러한 뉴런의 특정 격리가 필요합니다. 소 뇌 피 질 세포 밀도 및 셀 크기 고유 층에 의해 구분 된입니다. 이 세포질 건축 착 색 시 약 염료를 포함 하지 않고 신선한 냉동 조직 샘플에서 시각화 이상적입니다. 이론적으로,이 프로토콜 또한에 적용할 수 있는 비슷한 독특한 조직 다른 조직 유형 조직.

이 프로토콜은 인간의 사후 소 뇌의 Purkinje 세포 시각화를 위해 특별히 작동 하도록 설계 되었습니다. 수많은 프로토콜 고정, 시각화 및 조직의 많은 종류의 RNA 보존 목적의 두 IR-와 UV-LCM에 대 한 얼룩을 위한 존재 한다. UV LCM에 대 한 실험 설계를 고민 하는 경우 개인 필요와 시작 및 끝 재료의 요구 사항에 가장 적합 하 그들의 프로토콜에 맞게 해야 합니다. 여기, 우리가 transcriptome 수준 높은 RNA 준비 착 색 시 약을 포함 하는 염료의 필요 없이 사후 인간의 뇌에서 Purkinje 세포를 시각화에 대 한 향상 된 방법을 제공 하기 위해 다른 LCM 프로토콜의 여러 측면을 결합 시퀀싱.

Protocol

이 프로토콜에서 사용 하는 모든 인간의 샘플 동의를 얻은 고 컬럼비아 대학과 예일 대학에서 내부 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다. 참고: 이 프로토콜의 전체 처리 지침, 엄격한 RNA를 따라야 한다 그것에 의하여 gloved 손을 항상 사용, 모든 서피스는 RNase decontaminator로 청소는 모든 작동 물질이 RNA/DNA/Nuclease 무료. 1. 시작 LCM 이전 조직의…

Representative Results

이 프로토콜 UV LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 뇌 조직 준비 하는 단계를 자세히 설명 합니다. 철저 한 사양 및 주석 받는다 cryostat 절단, 정밀도의 고차를 가진 신선한 냉동된 뇌 조직을 절단 하는 것이 어려울 수 있습니다 대로. 고려해 야 할 가장 중요 한 포인트가입니다 신선한 냉동된 조직 매우 추운 이며 상당한은 cryostat의 따뜻한 온도에 적응 하는 시간이 필요 합니다….

Discussion

여기에 제시 된 프로토콜 특히 UV LCM에 대 한 시각화 하는 형태학 상으로 다른 조직에 스테인리스 접근 하도록 수정 됩니다. 이 메서드는 후속 직접 RNA 시퀀싱, 조직 시각화의 향상 된 수준을 유지 하면서 RNA 무결성을 최대화 하기 위해 설계 되었습니다. 가능한, 셀의 순수한 인구를 만드는 캡처, 다른 세포 유형 구별 하는 기능 이해 하는 인간의 조직¹⁵다른 분자 프로 파일에 대 한 …

Materials

MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.