Un protocolo de acero inoxidable para el aislamiento de ARN de alta calidad del Laser capturar las células Microdissected de Purkinje en el cerebelo humano Post-Mortem

Summary

Este protocolo utiliza un enfoque libre de manchas para visualizar y aislar a las células de Purkinje en tejido fresco congelado del cerebelo humano post-mortem mediante microdisección de captura láser. El propósito de este protocolo es generar cantidades suficientes de ARN de alta calidad para secuenciación del RNA.

Abstract

Microdisección de captura láser (LCM) es una herramienta ventajosa que permite la acumulación de las células citológico o fenotípicamente pertinentes o regiones de tejidos heterogéneos. Producto capturado se puede utilizar en una variedad de métodos moleculares para proteínas, aislamiento de DNA o RNA. Sin embargo, la preservación del ARN del tejido de cerebro humano postmortem es especialmente desafiante. Técnicas de visualización estándar para LCM requieren histologic o procedimientos de tinción inmunohistoquímica que pueden degradarán RNA. Por lo tanto, hemos diseñado un protocolo de acero inoxidable para la visualización de LCM con la finalidad de preservar integridad de RNA en tejido de cerebro humano postmortem. La célula de Purkinje del cerebelo es un buen candidato para la visualización de acero inoxidable, debido a su tamaño y localización característica. La corteza cerebelosa tiene distintas capas que difieren en la densidad celular, lo que un buen arquetipo para identificar bajo el microscopio de alta magnificación. Las células de Purkinje son neuronas grandes, situadas entre la capa de células del gránulo, que es una red densamente celular de neuronas pequeñas, y la capa molecular, que es escasa en cuerpos de la célula. Gracias a esta arquitectura, el uso de acero inoxidable visualización es factible. Otros sistemas de órganos o células que imitan este fenotipo sería convenientes. El protocolo de acero inoxidable está diseñado para fijar tejido congelado con etanol y eliminar lípidos con xileno para mejorar la visualización morfológica bajo microscopia ligera de alta magnificación. Este protocolo no tiene en cuenta otros métodos de fijación y está diseñado específicamente para las muestras de tejido fresco congelado con una radiación ultravioleta (UV)-sistema LCM. Aquí, presentamos un protocolo completo para el seccionamiento y la fijación de tejido cerebeloso humano fresco congelado post mortem y la purificación del ARN de las células de Purkinje aisladas por UV-LCM, preservando calidad de RNA para la posterior secuenciación del RNA. En nuestras manos, este protocolo produce niveles excepcionales de visualización celular sin necesidad de coloración de los reactivos y rendimientos RNA con números altos de integridad de RNA (≥8) según sea necesario para los experimentos de perfilamiento transcripcionales.

Introduction

Microdissection de la captura del laser (LCM) es una herramienta de investigación valiosa que permite la separación de células patológico relevantes para la posterior evaluación molecular conducida. El uso de análisis moleculares en estas muestras de tejido heterogéneo y la correlación con datos clínicos y patológicos es un paso necesario en la evaluación de la significación traslacional de la investigación biológica¹. Al analizar los datos de la expresión del gene del RNA, el uso de secciones congeladas del tejido es muy recomendable ya que permite excelente calidad de RNA como maximiza cantidad². Se ha establecido bien que alta calidad y la cantidad de RNA son esenciales para datos significativos de la secuencia de RNA³. Sin embargo, cuando se utiliza RNA de tejido fresco congelado post mortem para LCM, degradación de RNA es un gran desafío, como ocurre inmediatamente a la muerte y su extensión está mediada por diversos factores asociados con el tejido colección método^4,5 . Además, degradación de RNA se exacerba cuando se necesitan técnicas de tinción para reconocer detalles histologic e identificación de la célula. Especializado de tinciones, como la hematoxilina & eosina, tinción de Nissl, inmunofluorescencia e inmunohistoquímica son útiles para distinguir las células del estroma circundante pero han demostrado que degradan RNA y alterar la expresión de la transcripción perfiles⁶. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha creado un protocolo inoxidable específicamente diseñado para preservar la RNA para los propósitos de la secuencia de RNA después de aislamiento de LCM de neuronas de Purkinje en cerebelo humano post-mortem.

En el proceso de tejido fresco congelado para LCM, el método de fijación variable puede afectar tejido y RNA integridad. La fijación con formol es estándar para la preservación morfológica, pero causas Cross-linking pueden fragmento de RNA e interferir con amplificación de RNA⁷. Fijación del etanol es una alternativa mejor para el aislamiento de RNA, ya que es un fijador coagulante que no induce el cross-linking¹. Para mejorar la visualización de la morfología del tejido, xileno es la mejor opción, ya que elimina los lípidos de los tejidos. Sin embargo, se conocen limitaciones al utilizar xileno en LCM, como los tejidos pueden secarse y convertirse en frágiles causando fragmentación del tejido con láser captura⁷. Xileno es también una toxina volátil y debe ser manipulado correctamente en una campana de humos. Sin embargo, el xileno se ha demostrado para mejorar la visualización de tejido conservando también RNA integridad⁸. Por lo tanto, nuestro protocolo se centra en el uso de la fijación de etanol 70% y etanol deshidratación, seguido por incubación de xileno para claridad morfológica.

Es importante tener en cuenta los diferentes tipos de sistemas de Microdisección láser, como ha demostrado que difieren en la velocidad, precisión y calidad de RNA. El láser infrarrojo (IR) capture microdissection y los ultravioleta (UV) láser microhaz microdissection sistemas fueron ambas plataformas LCM novela que surgió casi al mismo tiempo⁸. El sistema IR-LCM emplea un “sistema de contacto” con una película termoplástica transparente colocada directamente en la sección del tejido y las células de interés selectivamente se adhieren a la película por impulsos de centrado de un laser del IR. Por otra parte, el sistema UV-LCM es un “sistema sin contacto”, por el que un rayo láser enfocado corta las celdas o regiones de interés en el tejido; dependiendo de la configuración en dos plataformas comerciales actualmente disponibles que utilizan un diseño de microscopio invertido o vertical, tejido se adquiere en un dispositivo de recolección por una onda de presión inducida por láser que catapulta contra la gravedad o el tejido es recogida por gravedad, respectivamente. Ventajas significativas del sistema UV-LCM incluyen adquisición de celular más rápido, libre de contaminación la colección con el método de no contacto y disección más precisa debido a un mucho más pequeño laser viga diámetro⁹. Este protocolo fue diseñado específicamente para un sistema de UV-LCM y no ha sido probado en un sistema IR-LCM. En cualquier diseño de sistema UV-LCM, al acumular las células en la tapa de la colección, el uso de un cubreobjetos que mejora la claridad celular en microscopia no es conveniente, como las células sería incapaces de entrar en la tapa de la colección. Por lo tanto, para mejorar la visualización de tejido, probamos el uso de gorras de colección opaco, que están diseñados para actuar como un cubreobjetos para visualización microscópica en sistemas UV-LCM, contra tapas de colección llena líquido. Gorras de colección llena líquido pueden ser difícil, ya que el líquido está sujeto a evaporación y debe reemplazarse con frecuencia mientras trabajaba en el microscopio. Tiempo se convierte en un factor importante para la estabilidad del RNA, como el tejido capturado disuelve inmediatamente⁷.

Nuestro laboratorio estudia los cambios neuropathologic post mortem en el cerebelo de pacientes con temblor esencial (ET) y neurodegenerativos relacionados con trastornos del cerebelo. Hemos demostrado cambios morfológicos en las células de Purkinje que distinguen casos ET versus controles, incluyendo un número reducido de células de Purkinje, aumentaron de la regresión dendrítica y una variedad de cambios axonales, que nos lleva a postular que Purkinje degeneración celular es una característica biológica de base en ET patogenesia^10,11,12,13. Transcripcional de perfiles se ha utilizado en muchas enfermedades neurológicas para explorar las bases moleculares subyacentes de los cambios degenerativos celulares. Sin embargo, pueden enmascarar la expresión de las transcripciones de baja abundancia o disminuir la detección de cambios moleculares que ocurren solamente en una pequeña población de afectados eficazmente perfiles transcripcionales de muestras heterogéneas, como las regiones de tejido cerebral, células, como células de Purkinje en la corteza cerebelosa. Por ejemplo, las células de Purkinje son ampliamente superados en número por las células del gránulo abundante en la corteza cerebelosa por aproximadamente 1: 3000; así, al objetivo eficazmente su transcriptoma requiere aislamiento específico de estas neuronas. La corteza cerebelosa está delineada por distintas capas que difieren en la densidad celular y el tamaño de la célula. Esta arquitectura celular es ideal para visualizar en una muestra de tejido congelado sin reactivos de tinción que contiene el tinte. En teoría, este protocolo también podría aplicarse a otros tipos de tejidos que tienen tejido distintivo similar organización.

Este protocolo fue diseñado para trabajar específicamente para visualización de células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem. Numerosos protocolos existen para la fijación, coloración visualización y RNA preservación de muchos tipos de tejidos para los propósitos de ambos LCM IR y UV. Cuando se contempla un diseño experimental para UV-LCM, individuos deben adaptar sus protocolos para adaptarse mejor a las necesidades y requisitos de inicio y fin de materiales. Aquí, se combinan muchos aspectos de diferentes protocolos de LCM para proporcionar un método mejorado para la visualización de las células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem sin necesidad de preparación de RNA de alta calidad para el transcriptoma de tinte que contiene reactivos de tinción secuencia.

Protocol

Todas las muestras humanas utilizadas en este protocolo se han obtenido con consentimiento informado y han sido aprobadas por la Junta interna de revisión (IRB) en la Universidad de Columbia y la Universidad de Yale. Nota: La totalidad de este protocolo debe seguir RNA estricto manejo de las directrices, por el que se utiliza siempre una mano enguantada, todas las superficies se limpian con un descontaminador de RNasa y todos los materiales de trabajo son RNA/DNA/nucleasa gra…

Representative Results

Este protocolo describe los pasos para preparación de tejido de cerebro humano postmortem fresco congelado para UV-LCM. Anotaciones y especificaciones completa se dan para corte en criostato, ya que puede ser difícil cortar tejido cerebral congelado fresco con un alto grado de precisión. El punto más importante a considerar es que el tejido fresco congelado es extremadamente frío y requiere una cantidad significativa de tiempo para aclimatarse a la temperatura más caliente de un cri…

Discussion

El protocolo presentado aquí es modificado específicamente para un enfoque inoxidable en visualizar morfológicamente distintos tejidos para UV-LCM. Este método está diseñado para maximizar la integridad del RNA para la posterior secuencia de RNA directa, manteniendo un mayor nivel de visualización de tejido. La capacidad de distinguir diferentes tipos de células para la captura, para crear la población pura de células posible, es esencial para la comprensión de diferentes perfiles moleculares en los tejidos hu…

Materials

MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.