Ett rostfritt protokoll för högkvalitativa RNA isolering från Laser fånga Microdissected Purkinje celler i människans postmortala lillhjärnan

Summary

Detta protokoll används en fläck-fri metod för att visualisera och isolera Purkinje celler i färskfryst vävnad från mänskliga postmortala lillhjärnan via laser fånga lokalt. Syftet med detta protokoll är att generera tillräckliga mängder av hög kvalitet RNA för RNA-sekvensering.

Abstract

Laser fånga lokalt (LCM) är ett fördelaktigt verktyg som möjliggör insamling av cytologically och/eller fenotypiskt relevanta celler eller regioner från heterogen vävnader. Fångade produkten kan användas i en mängd olika molekylära metoder för protein, DNA eller RNA isolering. Bevarandet av RNA från efter döden mänsklig hjärnvävnad är dock särskilt utmanande. Standard visualiseringstekniker för LCM kräver histologisk eller immunhistokemisk färgning förfaranden som kan ytterligare försämra RNA. Därför har vi utformat ett rostfritt protokoll för visualisering i LCM med syftet att bevara RNA i postmortala mänsklig hjärnvävnad. Purkinje cellen av lillhjärnan är en bra kandidat för rostfritt visualisering, på grund av dess storlek och karakteristiska läge. Cerebellar cortex har distinkta lager som skiljer sig i cell densiteten, vilket gör dem ett bra arketyp att identifiera under hög förstoring mikroskopi. Purkinje celler är stora nervceller som ligger mellan det granule celllagrar, som är ett tätt nät av små nervceller, och det molekylära lagret, som är gles i cellen organ. På grund av denna arkitektur är användningen av rostfritt visualisering genomförbart. Andra organ eller cell system som efterliknar denna fenotyp skulle också vara lämpliga. Det rostfria protokollet är utformat för att fixa färskfryst vävnad med etanol och ta bort lipider med xylen för förbättrade morfologiska Visualisering under hög förstoring ljusmikroskopi. Detta protokoll tar inte hänsyn till andra fixering metoder och är särskilt utformad för färskfryst vävnadsprover som tagits med en ultraviolett (UV)-LCM-systemet. Här presenterar vi ett komplett protokoll för snittning och fastställande färsk fryst postmortala mänsklig cerebellär vävnad och rening av RNA från Purkinje celler isoleras genom UV-LCM, samtidigt som RNA kvalitet för efterföljande RNA-sekvensering. I våra händer, detta protokoll producerar enastående nivåer av cellulära visualisering utan behov av färgning reagenser och avkastningar RNA med höga RNA integritet tal (≥8) som behövs för transkriptionell profilering experiment.

Introduction

Laser fånga lokalt (LCM) är en värdefull forskningsverktyg som tillåter separation av patologiskt relevanta celler för efterföljande molekylärt driven utvärdering. Användning av molekylära analyser i dessa heterogena vävnadsprover och sambandet med patologiska och kliniska data är ett nödvändigt steg i utvärdera translationell betydelsen av biologisk forskning¹. När man analyserar gen uttryck data från RNA, användning av frysta vävnadssnitt rekommenderas eftersom det ger utmärkt kvalitet av RNA som maximerad kvantitet². Det har också fastställts att hög kvalitet och kvantitet av RNA är viktigt för meningsfulla data från RNA-sekvensering³. När du använder RNA från färsk fryst post mortem vävnad för LCM, är RNA nedbrytning dock en stor utmaning, eftersom det sker omedelbart efter döden och dess utsträckning medieras av olika faktorer som är förknippade med vävnad samling metod^4,5 . Dessutom förvärras RNA nedbrytning när färgning tekniker behövs för att känna igen histologisk detaljer och cell identifiering. Specialiserade färgningsteknik, såsom hematoxylin och eosin, Nissl fläcken, immunofluorescens och immunohistokemi är till hjälp för att skilja celler från omgivande stroma men har visat sig försämra RNA och ändra avskrift uttryck profiler⁶. Vårt laboratorium har därför skapat ett rostfritt protokoll specifikt för att bevara RNA i postmortala mänskliga lillhjärnan för RNA-sekvensering efter LCM isolering av Purkinje nervceller.

I bearbetning färsk fryst vävnad för LCM, kan metoden fixering steglöst påverka både RNA och vävnad integritet. Formalin fixering är standard för morfologiska bevarande, men orsaker cross-linking som kan splittra RNA och störa RNA förstärkning⁷. Etanol fixering är ett bättre alternativ för RNA isolering, eftersom det är en coagulative fixativ som inte inducerar tvärbindande¹. För att förbättra visualisering av vävnad morfologi, är xylen det bästa valet, eftersom det tar bort lipider från vävnaden. Men finns det kända begränsningar när du använder xylen i LCM, som vävnader kan torka ut och bli sprött orsakar vävnad fragmentering vid laser fånga⁷. Xylen är också ett flyktiga toxin och måste hanteras korrekt i dragskåp. Xylen har dock visats öka vävnad visualisering samtidigt bevara RNA integritet⁸. Därför kretsar våra protokoll kring användningen av 70% etanol fixering och etanol uttorkning, följt av xylen inkubation i morfologiska klarhet.

Det är viktigt att notera de olika typerna av laser-baserad lokalt system, som de har visat sig skiljer sig i hastighet, precision och RNA kvalitet. Infraröd (IR) lasern fånga lokalt och ultraviolett (UV) lasern microbeam lokalt system var båda roman LCM-plattformar som uppstod nästan samtidigt⁸. IR-LCM systemet använder ett ”kontakt system” med en transparent termoplast film placeras direkt på avsnittet vävnad och celler av intresse följa selektivt filmen av fokuserad pulser från en IR-laser. Alternativt, UV-LCM systemet är en ”icke-kontakt” whereby en fokuserade laserstrålen skär bort cellerna eller regioner av intresse i vävnaden; beroende på konfigurationen i två tillgängliga kommersiella plattformar som använder antingen en inverterad eller upprätt Mikroskop design, vävnad förvärvas i en samling av en laser-inducerad tryckvågen som katapulter det mot gravitationen eller vävnad är samlas in av gravitation, respektive. Betydande fördelar av UV-LCM systemet inkluderar snabbare cell förvärv, förorening-fri samling med beröringsfri metod och mer precisa dissektion på grund av en mycket mindre laser beam diameter⁹. Detta protokoll utformades specifikt för ett UV-LCM-system och har inte testats i ett IR-LCM-system. I antingen UV-LCM systemdesign, när ackumulerande celler i samlingen GJP, användning av ett täckglas som förbättrar är cellulär tydlighet under mikroskopi inte lämplig, som cellerna skulle kunna träda i den samling gemensamma jordbrukspolitiken. Därför, för att öka vävnad visualisering, vi testade användningen av ogenomskinlig collection lock, som är utformade för att fungera som ett täckglas för mikroskopiska visualisering i UV-LCM system, mot flytande fyllda samling caps. Flytande fyllda samling caps kan vara en utmaning då vätskan är föremål för avdunstning och måste bytas oftare medan du arbetar på mikroskopet. Tiden blir en viktig faktor för RNA stabilitet, som fångade vävnaden upplöser omedelbart⁷.

Vårt laboratorium studier efter döden neuropatologiska förändringar i lillhjärnan av patienter med essentiell tremor (ET) och relaterade neurodegenerativa sjukdomar av lillhjärnan. Vi har visat morphologic ändringar centrerad på Purkinje celler som skiljer ET fall jämfört med kontroller, inklusive minskat antal Purkinje celler, ökade dendritiska regression och en mängd axonal förändringar, leder oss till postulerar att Purkinje cell degeneration är en core biologiska funktion i ET patogenes^10,11,12,13. Transkriptionell profilering har använts i många neurologiska sjukdomar för att utforska underliggande molekylära grunden för degenerativa cellförändringar. Dock kan transkriptionell profiler från heterogena prover, såsom vävnad hjärnregioner, effectually maskera uttryck för låg överflöd avskrifter eller minska detektion av molekylära förändringar som förekommer endast i en liten population av drabbade celler, såsom Purkinje celler i lillhjärnan cortex. Exempelvis är Purkinje celler kraftigt underläge av riklig granule celler i lillhjärnan cortex av ungefärligt 1:3000; således att effektivt rikta kräver deras transkriptom särskild isolering av dessa nervceller. Cerebellar cortex avgränsas av distinkta lager som skiljer sig i cell densiteten och Cellstorlek. Denna cellulära arkitektur är idealisk att visualisera i ett färskfryst vävnadsprov utan som innehåller färgämnet färgning reagenser. I teorin, detta protokoll skulle också kunna tillämpas på andra vävnadstyper av som har liknande särskiljande vävnad organisation.

Detta protokoll var ämnad att arbeta specifikt för Purkinje celler visualisering i mänskliga postmortala lillhjärnan. Det finns även många protokoll, ofta för fixering, färgning visualisering och RNA bevarandet av många typer av vävnader vid tillämpningen av både IR – och UV-LCM. När överväger en experimentell design för UV-LCM, bör individer skräddarsy sina protokoll för att bäst passa behoven och kraven av start- och slutdatum material. Här kombinerar vi många aspekter av olika LCM protokoll att tillhandahålla en förbättrad metod för att visualisera Purkinje celler i postmortala mänskliga lillhjärnan utan färgämne som innehåller färgning reagenser att förbereda högkvalitativa RNA för transkriptom sekvensering.

Protocol

Alla mänskliga prover som utnyttjas i detta protokoll har erhållits med informerat samtycke och har godkänts av den interna granskning Board (IRB) vid Columbia University och Yale University. Obs: Helheten av detta protokoll bör följa strikta RNA hantering riktlinjer, whereby en behandskade hand används alltid, alla ytor rengörs med ett RNase decontaminator och alla arbetsmaterial är RNA/DNA/Nuclease gratis. 1. testa RNA integritet vävnad fö…

Representative Results

Detta protokoll Detaljer stegen för att förbereda färska frysta postmortala mänsklig hjärnvävnad UV-LCM. Grundlig specifikationer och anteckningar ges för kryostaten skärning, eftersom det kan vara svårt att skära färska frysta hjärnvävnad med en hög grad av precision. Den viktigaste punkten att överväga är att färsk fryst vävnad är extremt kallt och kräver en betydande mängd tid anpassa sig till en kryostat varmare temperatur. Detta steg kan inte forceras, och det k…

Discussion

Det protokoll som presenteras här är specifikt modifierad för att vara ett rostfritt tillvägagångssätt visualisera morfologiskt skilda vävnader för UV-LCM. Denna metod är utformad för att maximera RNA integritet för efterföljande direkt RNA-sekvensering, samtidigt som en förbättrad nivå av vävnad visualisering. Förmåga att skilja olika celltyper för capture, för att skapa den renaste befolkningen av celler som möjligt, är viktigt för att förstå olika molekylära profiler i mänskliga vävnader<su…

Materials

MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70mm 100um	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.