Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10
Summary
Las mutaciones en el gen de la quinasa 2 de la leucina rica causan la enfermedad de Parkinson hereditaria. Hemos desarrollado un método fácil y robusto para evaluar la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 en neutrófilos de sangre periférica humana. Esto puede ayudar a identificar a las personas con aumento de la actividad de la vía de la quinasa LRRK2.
Abstract
La quinasa de repetición rica en leucina 2 (LRRK2) es el gen mutado con más frecuencia en la enfermedad hereditaria de Parkinson (PD) y todas las mutaciones patógenas de LRRK2 resultan en la hiperactivación de su función quinasa. Aquí, describimos un ensayo fácil y robusto para cuantificar la actividad de la vía quinasa LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica humana midiendo la fosforilación controlada por LRRK2 de uno de sus sustratos fisiológicos, Rab10 en la threonina 73. El análisis de inmunoblotting descrito requiere un anticuerpo totalmente selectivo y fosfoespecífico que reconozca el epítopeno Rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10. Utiliza neutrófilos de sangre periférica humana, porque la sangre periférica es fácilmente accesible y los neutrófilos son un componente abundante y homogéneo. Es importante destacar que los neutrófilos expresan niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab10. Un inconveniente potencial de los neutrófilos es su alta actividad intrínseca de proteasa de serina, que requiere el uso de inhibidores de la proteasa muy potentes como la neurotoxina organofosfora diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte del tampón de lisis. Sin embargo, los neutrófilos son un recurso valioso para la investigación de la actividad in vivo de la vía quinasa LRRK2 y deben considerarse para su inclusión en las colecciones de biorrepositorios de DP.
Introduction
Los intentos de reducir o detener la enfermedad de Parkinson (PD) han fracasado hasta ahora. El descubrimiento de mutaciones hiperactivadoras en la quinasa repetitiva rica en leucina 2 (LRRK2) que causan y/o aumentan el riesgo de DP ha llevado al desarrollo de inhibidores de la quinasa LRRK21,,2,,3. Estos han entrado ahora en ensayos clínicos4. La función exacta de LRRK2 no está clara, pero un avance importante ha sido la identificación de un subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluyendo Rab10, como los primeros sustratos fisiológicos de buena fe de la quinasa LRRK25,,6,7. Los principales desafíos en la era de las terapias modificadoras de la enfermedad son los marcadores bioquímicos del estado de activación de la quinasa LRRK2 y la participación objetivo de los inhibidores de la quinasa LRRK2.
Hasta ahora, el principal marcador farmacocinético de los inhibidores de LRRK2 in vivo ha sido un grupo de residuos de serina fosforilada constitutivamente de LRRK2, en particular la serina 935, que se desfosforilan en respuesta a diversos inhibidores de LRRK28,9. Sin embargo, la fosforilación de la serina 935 no se correlaciona con la actividad celular intrínseca de la quinasa LRRK2 porque no está fosforilada directamente por LRRK2 y sigue fosforiladaendo en LRRK210inactivo para la quinasa. La actividad de la quinasa LRRK2 se correlaciona bien con la autofosforilación de la serina 1292, pero en términos prácticos no es una lectura adecuada para la actividad endógena de la quinasa LRRK2 mediante el análisis de inmunoblot de extractos de células enteras debido a la falta actual de anticuerpos fiables y fosfoespecíficos para este sitio10,11.
Hemos desarrollado un ensayo robusto y fácil para cuantificar la actividad de la vía de la quinasa LRRK2 en células sanguíneas periféricas humanas que mide la fosforilación controlada por LRRK2 de su diana fisiológica Rab10 en la threonina 7311. La sangre periférica es fácilmente accesible por venesection, que es un procedimiento rápido y de bajo riesgo que causa un mínimo malestar. Nos centramos en los neutrófilos de sangre periférica humana porque constituyen una población abundante (37-80% de todos los glóbulos blancos) y células homogéneas que expresa niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab1011. Además, los neutrófilos de sangre periférica pueden aislarse de forma rápida y eficiente mediante el empleo de un enfoque negativo inmunomagnético. Para garantizar que la posterior fosforilación Rab10 observada sea mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos se incuba con o sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK2 (utilizamos y recomendamos MLi-2)2,12. Esto es seguido por la lisis celular en un tampón que contiene el inhibidor de la proteasa diisopropilo fluorofosfato (DIFP), que es necesario para suprimir la actividad intrínseca de la proteasa de serina que se sabe que es alta en neutrófilos13. Para el análisis final mediante inmunoblotting cuantitativo, recomendamos utilizar el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10 que detecta específicamente el Rab10 Thr73-fosfoepitope y no reacciona cruzadamente con otras proteínas Rab fosforiladas14. La selectividad y especificidad de este anticuerpo ha sido validada en modelos de sobreexpresión de diferentes proteínas Rab y una línea celular de nocaut A549 Rab1014. Por lo tanto, medimos la diferencia en la fosforilación de Rab10 en los lisatos de neutrófilos que han sido tratados con y sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK22. Alternativamente, las muestras también podrían ser analizadas por otros métodos, como la espectrometría cuantitativa de masas.
En conclusión, la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2 es un marcador superior de la actividad de quinasa LRRK2 a la fosforilación LRRK2 en la serina 935 y los neutrófilos de sangre periférica humana son un recurso valioso para la investigación de DP en LRRK2. Nuestro protocolo proporciona un ensayo robusto y fácil para interrogar la actividad de la vía LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica y permite la estratificación bioquímica de individuos con mayor actividad quinasa LRRK215. Es importante destacar que estos individuos pueden beneficiarse del futuro tratamiento con inhibidores de la quinasa LRRK2.
Protocol
Representative Results
Discussion
La evidencia clínica, genética y bioquímica convincente apunta hacia un papel importante para LRRK2 y, en particular, su función quinasa en la enfermedad de Parkinson7. Se han desarrollado inhibidores de la quinasa LRRK2 que están entrando en ensayos clínicos2,4,12. Como tal, es necesario explotar LRRK2 como biomarcador para la participación objetivo, así como la estratificación del paciente. Nue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los voluntarios sanos que amablemente donaron sangre para el presente estudio. Agradecemos a The Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) y al liderazgo del estudio Fox BioNet (FBN) por su apoyo y aportación hacia el protocolo escrito y el video. Agradecemos al profesor Alexander Zimprich, de la Universidad de Viena en Austria, por probar nuestro protocolo y colaboración. Valoramos las contribuciones de Paul Davies al proyecto (director general de la PPU de MRC). También reconocemos el excelente apoyo técnico de la Unidad de Fosforilación y Ubiquitilación de Proteínas MRC (PPU) a saber, Síntesis Química (Natalia Shpiro para la síntesis de MLi-2), Reactivos MRC PPU y equipos de purificación de anticuerpos (coordinados por Hilary McLauchlan y James Hastie). Agradecemos a Mhairi Towler y Fraser Murdoch de Vivomotion por su ayuda para hacer los videos y animaciones. Agradecemos a Steve Soave de 81 películas por su ayuda con las ediciones finales. Esther Sammler cuenta con el apoyo de una beca académica clínica sécoceses escocesa y ha recibido financiación de Parkinson’s UK (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
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