Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie
Summary
Mutaties in het leucine rijke reinase 2 gen (LRRK2) veroorzaken erfelijke de ziekte van Parkinson. We hebben een eenvoudige en robuuste methode ontwikkeld voor het beoordelen van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van Rab10 bij menselijke perifere bloedneutrofielen. Dit kan helpen bij het identificeren van personen met een verhoogde LRRK2 kinase traject activiteit.
Abstract
De leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is het meest gemuteerde gen bij erfelijke Parkinson’ ziekte (PD) en alle pathogene LRRK2 mutaties resulteren in hyperactivatie van de kinase functie. Hier beschrijven we een eenvoudige en robuuste test om LRRK2 kinase route activiteit in menselijke perifere bloed neutrofielen kwantificeren door het meten van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van een van de fysiologische substraten, Rab10 op threonine 73. De beschreven immunoblotting analyse vereist een volledig selectief en fosfospecifiek antilichaam dat de Rab10 Thr73 epitoop fosforylaat door LRRK2 herkent, zoals de MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam. Het maakt gebruik van menselijke perifere bloed neutrofielen, omdat perifere bloed is gemakkelijk toegankelijk en neutrofielen zijn een overvloedige en homogene bestanddeel. Belangrijk is dat neutrofielen relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 als Rab10 uitdrukken. Een potentieel nadeel van neutrofielen is hun hoge intrinsieke serine protease activiteit, die het gebruik van zeer krachtige proteaseremmers zoals de organofosfor neurotoxine diisopropylfluorosafosfaat (DIFP) als onderdeel van de lysisbuffer vereist. Niettemin zijn neutrofielen een waardevolle bron voor onderzoek naar lrrk2 kinase-padactiviteit in vivo en moeten ze in aanmerking komen voor opname in PD-biorepository-collecties.
Introduction
Pogingen om de ziekte van Parkinson (PD) te vertragen of te stoppen zijn tot nu toe mislukt. De ontdekking van hyperactiverende mutaties in de leucine rijke reinase 2 (LRRK2) die het risico voor PD veroorzaken en/of verhogen heeft geleid tot de ontwikkeling van LRRK2 kinase remmers1,2,3. Deze zijn nu opgenomen in klinische proeven4. De exacte functie van LRRK2 is onduidelijk, maar een belangrijke vooruitgang is de identificatie van een subset van Rab GTPase eiwitten, waaronder Rab10, als de eerste bonafide fysiologische substraten van de LRRK2 kinase5,6,7. Belangrijke uitdagingen in het tijdperk van ziekte-modificerende therapieën zijn biochemische markers van LRRK2 kinase activeringsstatus en doelbetrokkenheid van LRRK2 kinase remmers.
Tot nu toe was de belangrijkste farmacokinetische marker voor LRRK2-remmers in vivo een cluster van constitutieve fosforyllated serineresiduen van LRRK2, met name serine 935, die ontsmet raken in reactie op diverse LRRK2-remmers8,9. Serine 935 fosforylatie correleert echter niet met intrinsieke cellulaire LRRK2 kinaseactiviteit omdat het niet direct fosforylaat is door LRRK2 en nog steeds fosforylaat is in kinase-inactieve LRRK210. LRRK2 kinase activiteit correleert goed met autofoostie van serine 1292, maar het is in de praktijk geen geschikte uitlezing voor endogene LRRK2 kinase activiteit door immunoblot analyse van hele cel extracten als gevolg van het huidige gebrek aan betrouwbare en fosforspecifieke antilichamen voor deze site10,11.
We hebben een robuuste en eenvoudige test ontwikkeld om lrrk2 kinase-padactiviteit te kwantificeren in menselijke perifere bloedcellen die lrrk2-gecontroleerde fosforylatie van zijn fysiologische doeleiwit Rab10 bij threonine 7311meet. Perifeer bloed is gemakkelijk toegankelijk door geslachtsdeel, dat is een laag risico en snelle procedure die minimaal ongemak veroorzaakt. We richten ons op menselijke perifere bloedneutrofielen omdat ze een overvloedige (37-80% van alle witte bloedcellen) en homogene celpopulatie die relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 en Rab1011uitdrukt . Bovendien kunnen perifere bloedneutrofielen snel en efficiënt worden geïsoleerd door gebruik te maken van een immunomagnetische negatieve benadering. Om ervoor te zorgen dat de daaropvolgende waargenomen Rab10-fosforylatie wordt bemiddeld door LRRK2, wordt elke partij neutrofielen geïncubeerd met of zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase-remmer (we gebruiken en aanbevelen MLi-2)2,12. Dit wordt gevolgd door cellyse in een buffer met de proteaseremmer diisopropylfluorosafosfaat (DIFP), wat nodig is voor het onderdrukken van de intrinsieke serine protease activiteit waarvan bekend is dat hoog bij neutrofielen13. Voor de uiteindelijke analyse door kwantitatieve immunoblotting raden we aan om het MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam te gebruiken dat specifiek de Rab10 Thr73-phosphoepitope detecteert en niet cross-react met andere fosforylated Rab eiwitten14. Selectiviteit en specificiteit van dit antilichaam is gevalideerd in overexpressiemodellen van verschillende Rab-eiwitten en een A549 Rab10 knock-out cellijn14. Zo meten we het verschil in Rab10 fosforylatie in neutrofiele lysaten die zijn behandeld met en zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase remmer2. Als alternatief kunnen monsters ook worden geanalyseerd met andere methoden, zoals kwantitatieve massaspectrometrie.
Tot slot, LRRK2-gecontroleerde Rab10 fosforylatie is een superieure marker van LRRK2 kinase activiteit op LRRK2 fosforylatie op serine 935 en menselijke perifere bloed neutrofielen zijn een waardevolle bron voor PD onderzoek naar LRRK2. Ons protocol biedt een robuuste en eenvoudige test om LRRK2 trajectactiviteit te ondervragen in perifere bloedneutrofielen en maakt biochemische gelaagdheid mogelijk van personen met verhoogde LRRK2 kinase activiteit15. Belangrijk is dat dergelijke personen kunnen profiteren van toekomstige LRRK2 kinase remmer behandeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dwingend klinisch, genetisch en biochemisch bewijs wijst op een belangrijke rol voor LRRK2 en in het bijzonder de kinasefunctie bij de ziekte van Parkinson7. LRRK2 kinase remmers zijn ontwikkeld en zijn het invoeren van klinische proeven2,4,12. Als zodanig is er behoefte aan het exploiteren van LRRK2 als biomarker voor doelbetrokkenheid en patiëntgelaagdheid. Ons protocol beschrijft een robuuste en gemak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de gezonde vrijwilligers die vriendelijk bloed hebben gedoneerd voor de huidige studie. Wij danken The Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) en de Fox BioNet studie leiderschap (FBN) voor hun steun en input voor het geschreven protocol en de video. Wij danken professor Alexander Zimprich van de Universiteit van Wenen in Oostenrijk voor het testen van ons protocol en samenwerking. Wij waarderen de bijdragen van Paul Davies aan het project (general manager van de MRC PPU). We erkennen ook de uitstekende technische ondersteuning van de MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), namelijk Chemische Synthese (Natalia Shpiro voor de synthese van MLi-2), MRC PPU Reagentia en Services antilichaam zuiveringsteams (gecoördineerd door Hilary McLauchlan en James Hastie). Wij danken Mhairi Towler en Fraser Murdoch van Vivomotion voor hun hulp bij het maken van de video’s en animaties. Wij danken Steve Soave uit 81 films voor hulp bij de laatste bewerkingen. Esther Sammler wordt ondersteund door een Scottish Senior Clinical Academic Fellowship en heeft financiering ontvangen van Parkinson’s UK (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
