Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering
Summary
Mutationer i leucin rika upprepa kinas 2 genen (LRRK2) orsaka ärftliga Parkinsons sjukdom. Vi har utvecklat en enkel och robust metod för bedömning av LRRK2-kontrollerad fosforylering av Rab10 i humana perifera blodnetrofiler. Detta kan hjälpa till att identifiera individer med ökad LRRK2 kinas utbildningsavsnitt aktivitet.
Abstract
Leucin rika upprepa kinas 2 (LRRK2) är den vanligaste muterade genen i ärftliga Parkinsons sjukdom (PD) och alla patogena LRRK2 mutationer resultera i hyperaktivering av dess kinas funktion. Här beskriver vi en enkel och robust analys för att kvantifiera LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet i humant perifert blod neutrofiler genom att mäta LRRK2-kontrollerade fosforylering av en av dess fysiologiska substrat, Rab10 vid treonin 73. Den immunoblotting analys som beskrivs kräver en helt selektiv och fosphospecific antikroppar som känner igen Rab10 Thr73 epitop fosforylerad av LRRK2, såsom MJFF-pRab10 kanin monoklonala antikroppar. Den använder humant perifert blod neutrofiler, eftersom perifert blod är lättillgängligt och neutrofiler är en riklig och homogen beståndsdel. Viktigt, neutrofiler uttrycka relativt höga nivåer av både LRRK2 och Rab10. En potentiell nackdel med neutrofiler är deras höga inneboende serinproteas aktivitet, som kräver användning av mycket potenta proteashämmare såsom organofosfor neurotoxin diisopropylfluorofosfat (DIFP) som en del av lysis bufferten. Icke desto mindre, neutrophils är en värdefull resurs för forskning om LRRK2 kinas utbildningsavsnitt verksamhet in vivo och bör övervägas för införande i PD biorepository samlingar.
Introduction
Försök att bromsa eller stoppa Parkinsons sjukdom (PD) har hittills misslyckats. Upptäckten av hyperaktiverande mutationer i leucin rika upprepa kinas 2 (LRRK2) som orsakar och / eller öka risken för PD har lett till utvecklingen av LRRK2 kinashämmare1,2,3. Dessa har nu gått in i kliniska prövningar4. Den exakta funktionen av LRRK2 är oklart, men ett stort framsteg har varit identifiering av en delmängd av Rab GTPase proteiner, inklusive Rab10, som den första äkta fysiologiska substrat av LRRK2 kinas5,6,7. Viktiga utmaningar i en tid präglad av sjukdomsmodifierande therapeutics är biokemiska markörer för LRRK2 kinasaktiveringsstatus och målengagemang av LRRK2-kinashämmare.
Hittills har den huvudsakliga farmakokinetiska markören för LRRK2-hämmare in vivo varit ett kluster av konstituerande fosforylerade serinrester av LRRK2, särskilt serin 935, som blir defosforylerade som svar på olika LRRK2-hämmare8,9. Serin 935 fosforylering korrelerar dock inte med inneboende cellulärA LRRK2 kinas aktivitet eftersom det inte är direkt fosforyleras av LRRK2 och är fortfarande fosforylerade i kinas-inaktiva LRRK210. LRRK2 kinas aktivitet korrelerar väl med autofosforylering av serin 1292, men det är i praktiken inte en lämplig avläsning för endogenA LRRK2 kinas aktivitet genom immunblot analys av hela cellextrakt på grund av den nuvarande bristen på tillförlitliga och fosphospecific antikroppar för denna webbplats10,11.
Vi har utvecklat en robust och enkel analys för att kvantifiera LRRK2 kinas utbildningsavsnitt aktivitet i mänskliga perifera blodkroppar som mäter LRRK2-kontrollerad fosforylering av dess fysiologiska målprotein Rab10 vid treonin 7311. Perifert blod är lätt att nå genom venesection, vilket är en låg risk och snabb procedur som orsakar minimalt obehag. Vi fokuserar på humant perifert blod neutrofiler eftersom de utgör en riklig (37-80% av alla vita blodkroppar) och homogena cellpopulationer som uttrycker relativt höga nivåer av både LRRK2 och Rab1011. Dessutom kan perifert blod neutrofiler isoleras snabbt och effektivt genom att använda en immunomagnetisk negativ strategi. För att säkerställa att den efterföljande observerade Rab10-fosforyleringen medieras av LRRK2 inkuberas varje parti neutrofiler med eller utan en potent och selektiv LRRK2-kinashämmare (vi använder och rekommenderar MLi-2)2,12. Detta följs sedan av celllys i en buffert som innehåller proteashämmaren diisopropylfluofosfat (DIFP), vilket är nödvändigt för att undertrycka den inneboende serinproteasaktiviteten som är känd för att vara hög i neutrofiler13. För den slutliga analysen av kvantitativ immunblottning rekommenderar vi att du använder MJFF-pRab10 kanin monoklonala antikroppar som specifikt detekterar Rab10 Thr73-fosfoepitope och inte korsreagerar med andra fosforylerade Rab-proteiner14. Selektivitet och specificitet av denna antikropp har validerats i överuttryck modeller av olika Rab proteiner och en A549 Rab10 knock-out cellinje14. Således mäter vi skillnaden i Rab10 fosforylering i neutrofil lysates som har behandlats med och utan en potent och selektiv LRRK2 kinashämmare2. Alternativt kan prover också analyseras med andra metoder, till exempel kvantitativ masspektrometri.
Sammanfattningsvis är LRRK2-kontrollerade Rab10 fosforylering en överlägsen markör för LRRK2 kinas verksamhet till LRRK2 fosforylering vid serin 935 och humant perifert blod neutrofiler är en värdefull resurs för PD forskning i LRRK2. Vårt protokoll ger en robust och enkel analys för att förhöra LRRK2 utbildningsvägsaktivitet i perifera blodnetrofiler och möjliggör biokemisk stratifiering av individer med ökad LRRK2 kinasaktivitet15. Viktigt, sådana individer kan dra nytta av framtida LRRK2 kinas hämmare behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Övertygande kliniska, genetiska och biokemiska bevis pekar mot en viktig roll för LRRK2 och i synnerhet dess kinas funktion vid Parkinsons sjukdom7. LRRK2 kinashämmare har utvecklats och går in i kliniska prövningar2,,4,,12. Som sådan finns det ett behov av att utnyttja LRRK2 som biomarkör för målengagemang samt patientstratifiering. Vårt protokoll beskriver en robust och enkel analys för att a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar de friska frivilliga som vänligt donerat blod för den aktuella studien. Vi tackar Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) och Fox BioNet study leadership (FBN) för deras stöd och input till det skriftliga protokollet och videon. Vi tackar professor Alexander Zimprich från Wiens universitet i Österrike för att ha testat vårt protokoll och samarbete. Vi värdesätter Paul Davies bidrag till projektet (general manager för MRC PPU). Vi känner också igen det utmärkta tekniska stödet för MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU) nämligen kemisk syntes (Natalia Shpiro för syntes MLi-2), MRC PPU Reagenser och tjänster antikroppsrening team (samordnas av Hilary McLauchlan och James Hastie). Vi tackar Mhairi Towler och Fraser Murdoch från Vivomotion för deras hjälp med att göra videor och animationer. Vi tackar Steve Soave från 81 filmer för hjälp med de slutliga redigeringarna. Esther Sammler stöds av en skotsk Senior Clinical Academic Fellowship och har fått finansiering från Parkinsons Storbritannien (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
