Humanperifert blod nøytrofil isolasjon for å forhøre Parkinsons tilknyttede LRRK2 Kinase Pathway ved å vurdere Rab10 fosforylering
Summary
Mutasjoner i leucine rike gjenta kinase 2 genet (LRRK2) forårsake arvelig Parkinsons sykdom. Vi har utviklet en enkel og robust metode for å vurdere LRRK2-kontrollert fosforylering av Rab10 i humane perifere blodnøytrofiler. Dette kan bidra til å identifisere personer med økt LRRK2 kinase pathway aktivitet.
Abstract
Leucine rik gjenta kinase 2 (LRRK2) er det hyppigst muterte genet i arvelig Parkinsons sykdom (PD) og alle patogene LRRK2 mutasjoner resulterer i hyperaktivering av kinasefunksjonen. Her beskriver vi en enkel og robust analyse for å kvantifisere LRRK2 kinase pathway aktivitet i humane perifere blod nøytrofiler ved å måle LRRK2-kontrollert fosforylering av en av sine fysiologiske substrater, Rab10 ved threonine 73. Den immunoblotting analysen beskrevet krever et fullt selektivt og fosforspesifikt antistoff som gjenkjenner Rab10 Thr73 epitopfosforylert av LRRK2, slik som MJFF-pRab10 kanin monoklonalt antistoff. Den bruker humane perifere blod nøytrofiler, fordi perifert blod er lett tilgjengelig og nøytrofiler er en rikelig og homogen bestanddel. Viktigere, nøytrofiler uttrykker relativt høye nivåer av både LRRK2 og Rab10. En potensiell ulempe for nøytrofiler er deres høye egenserinproteaseaktivitet, som nødvendiggjør bruk av svært potente proteasehemmere som organofosfornevrotoksindiisopropylfluorfofat (DIFP) som en del av lysisbufferen. Likevel er nøytrofiler en verdifull ressurs for forskning på LRRK2 kinase pathway aktivitet in vivo og bør vurderes for inkludering i PD biorepositorisamlinger.
Introduction
Forsøk på å bremse eller stoppe Parkinsons sykdom (PD) har så langt mislyktes. Oppdagelsen av hyperaktiverende mutasjoner i leucinrike repetisjonkinase 2 (LRRK2) som forårsaker og/eller øker risikoen for PD har ført til utvikling av LRRK2 kinasehemmere1,2,3. Disse har nå inngått kliniske studier4. Den nøyaktige funksjonen til LRRK2 er uklar, men et stort fremskritt har vært identifisering av et undersett av Rab GTPase proteiner, inkludert Rab10, som de første bona fide fysiologiske substrater av LRRK2 kinase5,6,7. Viktige utfordringer i en tid med sykdomsmodifiserende terapeutiske midler er biokjemiske markører for LRRK2 kinase aktiveringsstatus og målengasjement av LRRK2 kinase hemmere.
Så langt har den viktigste farmakokinetiske markøren for LRRK2-hemmere in vivo vært en klynge av konstitutivt fosforert serinrester av LRRK2, spesielt serin 935, som blir defosforylert som svar på ulike LRRK2-hemmere8,9. Serine 935 fosforylering korrelerer imidlertid ikke med egencellulær LRRK2 kinase aktivitet fordi det ikke er direkte fosforylert av LRRK2 og er fortsatt fosforert i kinase-inaktiv LRRK210. LRRK2 kinase aktivitet korrelerer godt med autofosforylering av serin 1292, men det er i praksis ikke en egnet avlesning for endogene LRRK2 kinase aktivitet ved immunoblot analyse av hele celleekstrakter på grunn av dagens mangel på pålitelige og fosforspesifikke antistoffer for dette nettstedet10,11.
Vi har utviklet en robust og enkel analyse for å kvantifisere LRRK2 kinase pathway aktivitet i menneskelige perifere blodlegemer som måler LRRK2-kontrollert fosforylering av sitt fysiologiske målprotein Rab10 ved threonin 7311. Perifert blod er lett tilgjengelig ved veneseksjon, noe som er en lav risiko og rask prosedyre som forårsaker minimal ubehag. Vi fokuserer på humane perifere blod nøytrofiler fordi de utgjør en rikelig (37-80% av alle hvite blodlegemer) og homogen cellepopulasjon som uttrykker relativt høye nivåer av både LRRK2 og Rab1011. Videre kan perifere blod nøytrofiler isoleres raskt og effektivt ved å bruke en immunomagnetisk negativ tilnærming. For å sikre at den påfølgende observerte Rab10 fosforylering medieres av LRRK2, inkuberes hver gruppe nøytrofiler med eller uten en potent og selektiv LRRK2 kinasehemmer (vi bruker og anbefaler MLi-2)2,12. Dette etterfølges deretter av cellelyse i en buffer som inneholder proteasehemmeren diisopropylfluorofosfat (DIFP), som er nødvendig for å undertrykke den indre serinproteaseaktiviteten som er kjent for å være høy i nøytrofiler13. For den endelige analysen ved kvantitativ immunblotting anbefaler vi at du bruker MJFF-pRab10 kaninmonoklonalt antistoff som spesifikt oppdager Rab10 Thr73-fosfoepitop og ikke kryssreagerer med andre fosforerte Rab-proteiner14. Selektivitet og spesifisitet av dette antistoffet har blitt validert i overuttrykkmodeller av forskjellige Rab-proteiner og en A549 Rab10 knock-out celle linje14. Dermed måler vi forskjellen i Rab10 fosforylering hos nøytrofile lysater som har blitt behandlet med og uten en potent og selektiv LRRK2 kinasehemmer2. Alternativt kan prøver også analyseres ved andre metoder, for eksempel kvantitativ massespektrometri.
Til slutt er LRRK2-kontrollert Rab10 fosforylering en overlegen markør for LRRK2 kinase aktivitet til LRRK2 fosforylering ved serin 935 og humane perifere blod nøytrofiler er en verdifull ressurs for PD forskning på LRRK2. Vår protokoll gir en robust og enkel analyse for å avhøre LRRK2 pathway aktivitet i perifert blod nøytrofiler og tillater biokjemisk stratifisering av personer med økt LRRK2 kinase aktivitet15. Viktigere, slike individer kan ha nytte av fremtidig LRRK2 kinase hemmerbehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overbevisende klinisk, genetisk og biokjemisk bevis peker mot en viktig rolle for LRRK2 og spesielt kinasefunksjonen i Parkinsons sykdom7. LRRK2 kinasehemmere er utviklet og går inn i kliniske studier2,,4,12. Som sådan er det behov for å utnytte LRRK2 som en biomarkør for målengasjement samt pasientstratifisering. Vår protokoll beskriver en robust og enkel analyse for å analysere LRRK2 kinase pathw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de friske frivillige som vennligst donerte blod til den nåværende studien. Vi takker Michael J. Fox Foundation for Parkinsons Research (MJFF) og Fox BioNet-studieledelsen (FBN) for deres støtte og innspill til den skriftlige protokollen og videoen. Vi takker professor Alexander Zimprich fra Universitetet i Wien i Østerrike for å teste vår protokoll og samarbeid. Vi verdsetter bidragene fra Paul Davies til prosjektet (daglig leder av MRC PPU). Vi anerkjenner også den utmerkede tekniske støtten til MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), nemlig kjemisk syntese (Natalia Shpiro for syntesing av MLi-2), MRC PPU Reagenser og tjenester antistoffrenseteam (koordinert av Hilary McLauchlan og James Hastie). Vi takker Mhairi Towler og Fraser Murdoch fra Vivomotion for deres hjelp med å lage videoer og animasjoner. Vi takker Steve Soave fra 81 filmer for å få hjelp med de endelige redigerte. Esther Sammler støttes av en skotsk Senior Clinical Academic Fellowship og har mottatt støtte fra Parkinsons UK (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
