Summary

שימוש במיקרו מערכים לחקור השפעה מיקרוסביבתית על פנוטיפים סלולריים בסרטן

Published: May 21, 2019
doi:

Summary

מטרת השיטה המוצגת כאן היא להראות כיצד מיקרומערכים מיקרואקולוגיה (MEMA) ניתן לזייף ולהשתמש כדי לחקור את ההשפעה של אלפי קומבינטורית מיקרו סביבות פשוטות על הפנוטיפ של תאים מתורבתים.

Abstract

הבנת ההשפעה של המיקרוסביבה על הפנוטיפ של התאים היא בעיה קשה בשל התערובת המורכבת של שני גורמי גדילה מסיסים וחלבונים הקשורים מטריקס ב מיקרוסביבה ב vivo. יתר על כן, ריאגנטים זמין עבור מידול של מיקרו סביבות בתוך החוץ בדרך כלל לנצל תערובות מורכבות של חלבונים כי הם מוגדרים לחלוטין וסובלים אצווה להשתנות אצווה. פלטפורמת המיקרו-מיקרו של הסביבה (MEMA) מאפשרת הערכה של אלפי שילובים פשוטים של חלבונים מיקרוסביבתיים להשפעה שלהם על הפנוטיפים הסלולריים בתוך שיטת יחיד. MEMAs מוכנים צלחות היטב, אשר מאפשר תוספת של ליגונים בודדים להפריד בארות המכילות מטריקס מוליכי הרכב (ECM) חלבונים. השילוב של הליטרים מסיסים עם כל ECM מודפס יוצר שילוב ייחודי. שיטת MEMA טיפוסית מכילה יותר מ-2,500 מיקרוסביבות קומבינטורית ייחודיות שתאים חשופים אליהם בתוך שיטת יחיד. כמקרה מבחן, סרטן השד התאים קו MCF7 היה מצופה על פלטפורמת MEMA. ניתוח זה מזוהה גורמים שניהם לשפר ולעכב את הצמיחה והתפשטות של תאים אלה. פלטפורמת MEMA היא גמישה מאוד והוא יכול להיות מורחב לשימוש עם שאלות ביולוגיות אחרות מעבר למחקר הסרטן.

Introduction

Culturing של שורות תאים סרטניים על פלסטיק דו מימדי (2D) monolayers נשאר אחד הסוסים העיקריים עבודה עבור חוקרי סרטן. עם זאת, המיקרו-סביבה מוכרת יותר ויותר בשל יכולתה להשפיע על פנוטיפים סלולריים. בסרטן, מיקרוסביבה הגידול ידוע להשפיע על התנהגויות סלולר מרובות, כולל צמיחה, הישרדות, פלישה, ותגובה לטיפול1,2. תרביות תאים מסורתיים בדרך כלל חוסר השפעות מיקרו הסביבה, אשר הובילה לפיתוח של מורכב יותר תלת-מימדי (3d) בחני לגדול תאים, כולל מסחרית זמין מרתף מטוהרים מתחת תמציות קרום. עם זאת, אלה מטריצות מטוהרים הם בדרך כלל מורכבים להשתמש וסובלים מבעיות טכניות כגון השתנות אצווה3 וקומפוזיציות מורכבות3. כתוצאה מכך, זה יכול להיות קשה להקצות פונקציה חלבונים ספציפיים שעשויים להשפיע על פנוטיפים סלולריים3.

כדי לטפל במגבלות אלה, פיתחנו את הטכנולוגיה microenvironment מיקרו-הסביבה (mema), אשר מפחית את המיקרו-סביבה עד שילובים פשוטים של מטריקס מטריצה (ecm) ומסיס גורם צמיחה חלבונים4,5 . פלטפורמת MEMA מאפשרת זיהוי של גורמים מיקרוסביבתיים דומיננטי המשפיעים על התנהגות של תאים. באמצעות תבנית מערך, ניתן לקבל בניסוי אחד אלפי שילובים של גורמי מיקרו-סביבה. MEMA תיאר כאן חוקר שערים ~ 2,500 שונים בתנאים מיקרו סביבה ייחודית. חלבונים מסוג ECM המודפסים בלוחות הגידול של הטופס שעליהם יכולים להיות מתורבתים. ליגפות מסיסים מתווספים לבארות בודדות, ויוצרות קומבינטורית מיקרו-סביבות ייחודיות (ECM + ligands) בכל נקודה שונה אליה נחשפים התאים. תאים הם מתורבתים במשך מספר ימים, לאחר מכן קבוע, מוכתם, והתמונה כדי להעריך פנוטיפים הסלולר כתוצאה של חשיפה אלה שילובים ספציפיים מיקרו הסביבה. מאז המיקרוסביבות הם שילובים פשוטים, זה פשוט לזהות חלבונים כי כונן שינויים פנוטימית עיקריים בתאים. Memas השתמשו בהצלחה כדי לזהות גורמים המשפיעים על מספר פנוטיפים סלולריים, כולל אלה כי כונן החלטות הגורל תא תגובה לטיפול4,5,6,7. תגובות אלה ניתן לאמת בניסויים 2D פשוטים ולאחר מכן ניתן להעריך בתנאים כי יותר לכידה מלאה של המורכבות של מיקרוסביבה הגידול. פלטפורמת MEMA היא להתאים מאוד למגוון של סוגי תאים ונקודות קצה, בתנאי כי בסמנים פנוטיפים טובים זמינים.

Protocol

הערה: מבט כולל על תהליך MEMA כולו, כולל זמן משוער, מתואר בדיאגרמת הזרימה המוצגת באיור 1. פרוטוקול זה מפרט את הייצור של MEMAs בצלחות בנות 8. הפרוטוקול עשוי להיות מותאם עבור לוחות אחרים או שקופיות. 1. הכנת מאגרי חלבונים, מדלל וכתמים מבחנות של ECMs, ליגניות, …

Representative Results

כדי לפשט השפעות מיקרוסביבתיות על צמיחת תאים והתפשטות ועל מנת לזהות תנאים שקידמו או מעכבות את צמיחת התאים וההפצה, התאים הסרטניים בסרטן השד MCF7 הופרה על סט של שמונה 8-טוב MEMAs כפי שמתואר בפרוטוקול. שיטת הפעולה חשפה את התאים ל-48 ECMs שונים ו57 ליגפות שונות, עבור סך של 2736 קומבינטורית מיקרו תנאים סביב?…

Discussion

חשיבותה של “ממדי” והקשר היה גורם מניע בפיתוח במערכות תרבות מבחנה ככלים לאפיון תאים סרטניים באמצעות האינטראקציה שלהם עם המיקרו-סביבה11, והיכולת של מבחנה מערכות תרבות לחקות את הסביבה vivo הוא כוח המניע מאחורי החיפוש כדי לשפר את מערכות התרבות. אולם, במערכות חוץ גופית, נותרו כלים משמ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי ספריית הקרן המשותפת של NIH של הרשת חתימות סלולריות (LINCS) גרנט HG008100 (J.W.G., L.M.H., ו-J. E. K).

Materials

Aushon 2470 Aushon BioSystems Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA Nikon High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler BioTek liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution Sigma T2069
EDTA Invitrogen 15575-038
Glycerol Sigma G5516
Triton X100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P7949
Kolliphor P338 BASF 50424591
384-well microarray plate, cylindrical well Thermo Fisher ab1055
Nunc 8 well dish Thermo Fisher 267062
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Science 15710
BSA Fisher BP-1600
Sodium Azide Sigma S2002
Cell Mask Molecular Probes H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor Molecular Probes C10357
DAPI Promo Kine PK-CA70740043
ALCAM R & D Systems 656-AL ECM
Cadherin-20 (CDH20) R & D Systems 5604-CA ECM
Cadherin-6 (CDH6) R & D Systems 2715-CA ECM
Cadherin-8 (CDH8) R & D Systems 188-C8 ECM
CD44 R & D Systems 3660-CD ECM
CEACAM6 R & D Systems 3934-CM ECM
Collagen I Cultrex 3442-050-01 ECM
Collagen Type II Millipore CC052 ECM
Collagen Type III Millipore CC054 ECM
Collagen Type IV Sigma C5533 ECM
Collagen Type V Millipore CC077 ECM
COL23A1 R & D Systems 4165-CL ECM
Desmoglein 2 R & D Systems 947-DM ECM
E-cadherin (CDH1) R & D Systems 648-EC ECM
ECM1 R & D Systems 3937-EC ECM
Fibronectin R & D Systems 1918-FN ECM
GAP43 Abcam ab114188 ECM
HyA-500K R & D Systems GLR002 ECM
HyA-50K R & D Systems GLR001 ECM
ICAM-1 R & D Systems 720-IC ECM
Laminin Sigma L6274 ECM
Laminin-5 Abcam ab42326 ECM
Lumican R & D Systems 2846-LU ECM
M-Cad (CDH15) R & D Systems 4096-MC ECM
Nidogen-1 R & D Systems 2570-ND ECM
Osteoadherin/OSAD R & D Systems 2884-AD ECM
Osteopontin (SPP) R & D Systems 1433-OP ECM
P-Cadherin (CDH3) R & D Systems 861-PC ECM
PECAM1 R & D Systems ADP6 ECM
Tenascin C R & D Systems 3358-TC ECM
VCAM1 R & D Systems ADP5 ECM
vitronectin R & D Systems 2308-VN ECM
Biglycan R & D Systems 2667-CM ECM
Decorin R & D Systems 143-DE ECM
Periostin R & D Systems 3548-F2 ECM
SPARC/osteonectin R & D Systems 941-SP ECM
Thrombospondin-1/2 R & D Systems 3074-TH ECM
Brevican R & D Systems 4009-BC ECM
Elastin BioMatrix 5052 ECM
Fibrillin Lynn Sakai Lab OHSU N/A ECM
ANGPT2 RnD_Systems_Own 623-AN-025 Ligand
IL1B RnD_Systems_Own 201-LB-005 Ligand
CXCL8 RnD_Systems_Own 208-IL-010 Ligand
IGF1 RnD_Systems_Own 291-G1-200 Ligand
TNFRSF11B RnD_Systems_Own 185-OS Ligand
BMP6 RnD_Systems_Own 507-BP-020 Ligand
FLT3LG RnD_Systems_Own 308-FK-005 Ligand
CXCL1 RnD_Systems_Own 275-GR-010 Ligand
DLL4 RnD_Systems_Own 1506-D4-050 Ligand
HGF RnD_Systems_Own 294-HGN-005 Ligand
Wnt5a RnD_Systems_Own 645-WN-010 Ligand
CTGF Life_Technologies_Own PHG0286 Ligand
LEP RnD_Systems_Own 398-LP-01M Ligand
FGF2 Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG Ligand
FGF6 RnD_Systems_Own 238-F6 Ligand
IL7 RnD_Systems_Own 207-IL-005 Ligand
TGFB1 RnD_Systems_Own 246-LP-025 Ligand
PDGFB RnD_Systems_Own 220-BB-010 Ligand
WNT10A Genemed_Own 90009 Ligand
PTN RnD_Systems_Own 252-PL-050 Ligand
BMP3 RnD_Systems_Own 113-BP-100 Ligand
BMP4 RnD_Systems_Own 314-BP-010 Ligand
TNFSF11 RnD_Systems_Own 390-TN-010 Ligand
CSF2 RnD_Systems_Own 215-GM-010 Ligand
BMP5 RnD_Systems_Own 615-BMC-020 Ligand
DLL1 RnD_Systems_Own 1818-DL-050 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 296-HR-050 Ligand
KNG1 RnD_Systems_Own 1569-PI-010 Ligand
GPNMB RnD_Systems_Own 2550-AC-050 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 350-NS-010 Ligand
IL15 RnD_Systems_Own 247-ILB-005 Ligand
TNF RnD_Systems_Own 210-TA-020 Ligand
IGFBP3 RnD_Systems_Own 675-B3-025 Ligand
WNT3A RnD_Systems_Own 5036-WNP-010 Ligand
PDGFAB RnD_Systems_Own 222-AB Ligand
AREG RnD_Systems_Own 262-AR-100 Ligand
JAG1 RnD_Systems_Own 1277-JG-050 Ligand
BMP7 RnD_Systems_Own 354-BP-010 Ligand
TGFB2 RnD_Systems_Own 302-B2-010 Ligand
VEGFA RnD_Systems_Own 293-VE-010 Ligand
IL6 RnD_Systems_Own 206-IL-010 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 351-FS-010 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 378-SM Ligand
IGFBP2 RnD_Systems_Own 674-B2-025 Ligand
SHH RnD_Systems_Own 1314-SH-025 Ligand
FASLG RnD_Systems_Own 126-FL-010 Ligand

References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

Play Video

Cite This Article
Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D., Gross, S., Sudar, D., Bucher, E., Nederlof, M., Dane, M., Gray, J. W., Heiser, L., Korkola, J. E. Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer. J. Vis. Exp. (147), e58957, doi:10.3791/58957 (2019).

View Video