마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문
Summary
여기에 제시된 방법의 목적은 미세 환경 마이크로어레이(MEMA)가 배양된 세포의 표현형에 대한 수천 개의 간단한 조합 미세 환경의 영향을 심문하기 위해 제조되고 사용될 수 있는 방법을 보여주는 것입니다.
Abstract
미세 환경이 세포의 표현형에 미치는 영향을 이해하는 것은 생체 내 미세 환경에서 수용성 성장 인자와 매트릭스 관련 단백질의 복잡한 혼합물로 인해 어려운 문제입니다. 또한, 시험관 내 미세 환경의 모델링을 위해 쉽게 사용할 수 있는 시약은 일반적으로 불완전하게 정의되고 배치 가변성으로 고통받는 단백질의 복잡한 혼합물을 이용합니다. 미세 환경 마이크로어레이(MEMA) 플랫폼은 단일 분석에서 세포 표현형에 미치는 영향에 대해 수천 가지의 미세 환경 단백질 조합을 평가할 수 있습니다. MEMA는 배열된 세포외 매트릭스(ECM) 단백질을 포함하는 우물을 분리하기 위해 개별 리간드를 첨가할 수 있는 웰 플레이트에 제조됩니다. 각 인쇄 된 ECM과 수용성 리간드의 조합은 독특한 조합을 형성한다. 전형적인 MEMA 분석은 세포가 단 하나 분석에서 드러내는 2,500의 유일한 조합 마이크로환경을 포함합니다. 시험 사례로서, 유방암 세포주 MCF7은 MEMA 플랫폼에서 도금되었다. 이 분석법의 분석은 이 세포의 성장 그리고 증식을 강화하고 억제하는 둘 다 인자를 확인했습니다. MEMA 플랫폼은 매우 유연하며 암 연구 를 넘어 다른 생물학적 질문과 함께 사용하기 위해 확장 될 수 있습니다.
Introduction
2차원(2D) 단층에서 플라스틱에 암 세포주를 배양하는 것은 암 연구자들의 주요 주력 중 하나입니다. 그러나, 미세 환경은 점점 세포 표현형에 영향을 미치는 그것의 기능에 대 한 인식 되 고. 암에서, 종양 미세환경은 성장, 생존, 침습 및치료요법에대한 반응 1,2를포함하는 다중 세포 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 전통적인 단층 세포 배양은 전형적으로 미세 환경 영향이 결여되어, 이는 시판되는 정제된 지하 막 추출물을 포함하여 세포를 성장시키기 위해 보다 복잡한 3차원(3D) 어설법의 발달을 주도하고 있다. 그러나, 이러한 정제된 행렬은 전형적으로 사용하기가 복잡하고 배치 가변성3 및 복잡한 조성물3과같은 기술적 문제로 고통받고 있다. 그 결과, 세포 표현형 3에 영향을 미칠 수 있는 특정 단백질에기능을 할당하는 것은 어려울 수 있습니다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 세포 외 매트릭스 (ECM) 및 수용성 성장 인자 단백질4,5의 간단한 조합으로 미세 환경을 감소시키는 미세 환경 마이크로 어레이 (MEMA) 기술을 개발했습니다. . MEMA 플랫폼은 세포의 거동에 영향을 미치는 지배적인 미세 환경 요인을 식별할 수 있게 합니다. 배열 형식을 사용하면 단일 실험에서 수천 개의 미세 환경 요인 조합을 분석할 수 있습니다. 여기에 기술된 MEMA는 ~ 2,500개의 상이한 독특한 미세 환경 조건을 심문합니다. 잘 판에 인쇄된 ECM 단백질은 세포가 배양될 수 있는 성장 패드를 형성합니다. 수용성 리간드가 개별 우물에 첨가되어 세포가 노출되는 각 다른 지점에 고유한 조합 미세 환경(ECM + 리간드)을 생성합니다. 세포는 이러한 특정 미세 환경 조합에 노출의 결과로 세포 표현형을 평가하기 위해 며칠 동안 배양된 다음 고정, 염색 및 이미지화됩니다. 미세 환경은 간단한 조합이기 때문에 세포의 주요 현상형 변화를 유도하는 단백질을 식별하는 것은 간단합니다. MEMA는 세포 운명 결정 및 치료 4,5,6,7에대한 반응을 유도하는 요인을 포함하여 다중 세포 표현형에 영향을 미치는 요인을 확인하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 반응은 간단한 2D 실험에서 검증될 수 있고 종양 미세 환경의 복잡성을 보다 완전하게 재입증하는 조건하에서 평가될 수 있다. MEMA 플랫폼은 좋은 표현형 바이오마커를 사용할 수 있는 경우 다양한 세포 유형 및 종점에 매우 적응할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
“차원성”과 맥락의 중요성은 미세 환경(11)과의상호 작용을 통해 암세포의 특성화에 도구로서 시험관 내 배양 시스템의 개발에 동기 부여 요인이되었습니다 11, 및 생체 외에서의 능력 생체 내 환경을 모방하는 문화 시스템은 이러한 문화 시스템을 개선하기 위한 탐구의 원동력입니다. 그러나 체외 시스템은 복잡한 생체 내 상황을 단순화된 모델12로증류하는 능?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 네트워크 셀룰러 서명 (LINCS) 보조금 HG008100 (J.W.G., L.M.H., 및 J.E.K)의 NIH 공통 기금 라이브러리에 의해 지원되었다.
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
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