Använda Microarrays att förhöra mikromiljö påverkan på cellulära fenotyper i cancer
Summary
Syftet med den metod som presenteras här är att visa hur mikromiljö Microarrays (Mema) kan tillverkas och används för att förhöra effekten av tusentals enkla kombinatoriska mikromiljöer på fenotyp av odlade celler.
Abstract
Förstå effekterna av mikromiljön på fenotypen av celler är ett svårt problem på grund av den komplexa blandningen av både lösliga tillväxtfaktorer och Matrix-associerade proteiner i mikromiljön in vivo. Dessutom finns lättillgängliga reagenser för modellering av mikromiljöer in vitro vanligtvis använda komplexa blandningar av proteiner som är ofullständigt definierade och lider av batch till sats variation. Mikromiljö microarray (Mema) plattform möjliggör bedömning av tusentals enkla kombinationer av mikromiljö proteiner för deras inverkan på cellulära fenotyper i en enda analys. De Memas är beredda i bra tallrikar, som gör det möjligt att tillägg av enskilda ligander att separera brunnar som innehåller klädd extracellulära matrix (ECM) proteiner. Kombinationen av den lösliga ligand med varje tryckt ECM bildar en unik kombination. En typisk MEMA-analys innehåller mer än 2 500 unika kombinatoriska mikromiljöer som celler exponeras för i en enda analys. Som ett testfall, bröstcancer cellinjer MCF7 var pläterad på MEMA plattformen. Analys av denna analys identifierade faktorer som både förbättra och hämma tillväxten och spridningen av dessa celler. MEMA-plattformen är mycket flexibel och kan utökas för användning med andra biologiska frågor utöver cancerforskning.
Introduction
Odling av cancer cellinjer på plast i tvådimensionella (2D) enskiktslager är fortfarande en av de stora arbetshästar för cancerforskare. Emellertid, mikromiljön är alltmer erkänns för dess förmåga att påverka cellulära fenotyper. I cancer, tumören mikromiljö är kända för att påverka flera cellulära beteenden, inklusive tillväxt, överlevnad, invasion, och svar på terapi1,2. Traditionella enskiktslager cellkulturer saknar typiskt mikromiljö influenser, vilket har lett till utvecklingen av mer komplexa tredimensionella (3D) analyser för att odla celler, inklusive kommersiellt tillgängliga renade basalmembran extrakt. Men dessa renade matriser är vanligtvis komplicerade att använda och lider av tekniska problem såsom batchvariation3 och komplexa kompositioner3. Som ett resultat, det kan vara svårt att tilldela funktion till specifika proteiner som kan påverka cellulära fenotyper3.
För att hantera dessa begränsningar, har vi utvecklat mikromiljö microarray (Mema) teknik, vilket minskar mikromiljön ner till enkla kombinationer av extracellulära matrix (ECM) och lösliga tillväxtfaktor proteiner4,5 . MEMA-plattformen möjliggör identifiering av dominerande mikromiljöfaktorer som påverkar cellernas beteende. Genom att använda ett matrisformat kan tusentals kombinationer av mikromiljöfaktorer analyseras i ett enda experiment. Mema beskrivs här förhör ~ 2 500 olika unika mikromiljö villkor. ECM-proteiner tryckta i väl plåtar bildar tillväxt kuddar på vilka celler kan odlas. Lösliga ligander läggs till enskilda brunnar, skapa unika kombinatoriska mikromiljöer (ECM + ligand) på varje annan plats som cellerna exponeras. Celler odlas i flera dagar, sedan fast, färgas, och avbildas för att bedöma cellulära fenotyper som en följd av exponering för dessa specifika mikromiljö kombinationer. Eftersom mikromiljöerna är enkla kombinationer är det enkelt att identifiera proteiner som driver stora fenotypiska förändringar i cellerna. Memas har använts framgångsrikt för att identifiera faktorer som påverkar flera cellulära fenotyper, inklusive de som driver cell öde beslut och svar på terapi4,5,6,7. Dessa svar kan valideras i enkla 2D experiment och kan sedan bedömas under förhållanden som mer fullständigt recapitulate komplexiteten i tumören mikromiljö. MEMA-plattformen är mycket anpassningsbar till en mängd olika celltyper och endpoints, förutsatt att goda fenotypiska biomarkörer finns tillgängliga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vikten av “dimensionalitet” och sammanhang har varit en motiverande faktor i utvecklingen av in vitro-kultursystem som verktyg i karakterisering av cancerceller genom deras interaktion med mikromiljö11, och förmågan hos in vitro- kultur system för att efterlikna in vivo-miljön är en drivande kraft bakom strävan att förbättra dessa kultur system. In vitro-system är dock fortfarande betydande verktyg för cancerforskning just på grund av deras förmåga att destillera den komplexa in vivo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH gemensam fond bibliotek av Network cellulära signaturer (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., och J. E. K).
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
