萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離
Summary
この記事は、ex vivo キメラ器官を形成して結合することができますウズラと鶏の胚から純粋な萌芽期ティッシュを分離する方法を提供します。
Abstract
萌芽期ティッシュを分離する能力は、順番発表発生生物学における主要なプロセスへの明白な貢献を提供しているうずら鶏キメラ システムを確立するための重要なステップだった。
ここにはうずらとマイクロサージェリーとその生物学的特性を維持しながら酵素消化による鶏胚組織を分離するための最適化手法を説明しました。分離後、両種から組織は 48 h. ウズラの in vitro における切片アッセイ、関連付けられて、ニワトリ組織は明瞭な核機能と細胞間クロストークの検討できるように分子マーカーによって差別することができます。異種組織の協会。このアプローチは、したがって、前腸の形成と咽頭の形態形成時に発生するものなど、非常にダイナミックな空間変更と発達過程の複雑な組織の相互作用を研究するための便利なツール内胚葉由来の器官。この実験的アプローチは、胸腺形成の初期段階における上皮・間葉相互作用を最初に開発されました。これは、内胚葉由来の将来胸腺原基と中胚葉由来の間充織であったウズラと鶏の胚から分離。
鶏胚漿尿膜 (CAM) にそれらを移植で臓器を生成する関連組織の容量をさらにテストできます。カムは栄養素を提供し、explanted ティッシュにガス交換をできます。Ovo 開発の 10 日後は、キメラの臓器収穫植で従来の形態学的方法で分析できます。この手順も可能、初期開発 (体外) からの器官形成中に組織固有の貢献を勉強 (ovo 開発) における器官形成の最終段階です。
最後に、改善された分離メソッドも提供します立体的 (3 D) 保持萌芽期ティッシュのティッシュ特定の遺伝子発現パターンの高解像度地形解析も使用できます。
Introduction
1970 年代初頭のエレガントなウズラ鶏キメラ システムは開発1,2の間に細胞の遊走や細胞間相互作用の役割を理解する新たな道を開くル Douarin によって開発されました。2 種間のセル交換が大幅胚形成、神経系の形成、造血など数多くの発達過程を研究するために使用するとき後で確認を妨げないことを前提に考案されたモデルシステム1。後者の例として取って、造血前駆細胞胸腺上皮原基を植民地化の周期波最初うずら鶏キメラ システム3を使用してを観察されました。そのため胸腺、第三および第四咽頭ポーチ (3/4 pp) の内胚葉の未探査地域機械的および酵素によってから分離されたウズラ (q) 胚体節段階 15-30 [日 (E) 1.5-E2.5].これらの段階は、チキン ハンバーグとハミルトン4 (HH) – 12-17 の段階に対応します。分離のプロシージャは、トリプシン酵素によって添付充から内胚葉を分離するに使用を開始しました。孤立した内胚葉は、E3 E3.5 (HH-ステージ 20 21) でホスト鶏 (c) 胚の somatopleura 領域に移植されました。この異種間充織は器官形成3にも貢献して胸腺上皮の開発に「寛容な」と考えられていた。その後、鶏ホスト血液媒介性前駆細胞の連続波はウズラ ドナー胸腺の上皮の相手はホスト胚3で胸腺形成に貢献することを浸透させた。
最近では、このアプローチの修正版は、胸腺形成5初期における上皮間葉相互作用を研究するために重要であることもわかった。この点で、キメラ胚3では異所性胸腺形成に関与する組織が分離、両方のドナーとホストの胚から・前のヴィヴォ関連付けられています。改良されたプロトコルは、ウズラ 3/4 pp 内胚葉 (E2.5 E3) および鶏 somatopleura 中胚葉 (E2.5 E3) を分離する使用されました。簡単に言えば、萌芽期ティッシュはマイクロサージャリーであり、体外パンクレアチン消化を分離した.また、組織型と発達段階 (表 1) によると、酵素の消化力、温度、培養時間の条件が最適化されました。
次に、隔離されたティッシュ関連していた、切片、48 時間培養システムで以前に報告された5,6として。体外組織協会は、生体内での操作のいくつかの制限を克服するための胚のローカルの細胞間相互作用を模倣します。このシステムは咽頭の装置の開発などの複雑な形態形成イベントで細胞間相互作用の研究に特に有用です。
胸腺の組織構築の各組織の貢献だけでなく、胸腺を生成する異種の協会の能力さらに探検使用カム方法論、以前詳細5,7,8をすることができます。簡潔に、培養組織は cE8 胚のカムに接ぎ木され 10 日間の卵の開発を許可しました。その後、胸腺形成は収穫の外植体における形態素解析によって評価しました。3古典的なウズラ鶏研究のようにウズラの胸腺上皮臓器開発9,10 に貢献する後で示されていたニワトリ胚由来造血前駆細胞 (HPCs) によって植民地だった.HPCs は胚から高度に血管カム5,7,8を通じて異所性キメラ胸腺に移行。ウズラ派生胸腺上皮特異的抗体 (すなわち、QCPN-MAb ウズラ核)、組織特異的分子マーカーの必要性を克服する免疫組織化学によって識別できます。
この実験前文書8で報告される 2 段階のアプローチとして、体外および ovo 開発において薬理学的エージェントの規則的な管理によって信号経路の変調をできます。また、植はもちろん実験8の任意の時点で収穫できます。
ここで詳細な分離のプロトコルは最後に、自然のプロパティの保存と萌芽期ティッシュの萌芽期の地域の場での遺伝子発現パターンをそれ以外の場合詳細設定に特に役立つの 3 D アーキテクチャによってアクセスできません。従来の方法。さらに、RNA シーケンスなどのマイクロ アレイ、トランスクリプトーム解析のアプローチは、組織固有の高スループット オミクス解析を提供しながら遺伝マーカーを必要とせず隔離されたティッシュの適用もできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
以下萌芽期ティッシュの隔離プロシージャは、異なる生物学的文脈3,5,6うずら鶏キメラ胚を作り出すための前の技術から改善されました。
この方法は、遺伝子操作や決定、遺伝子組み換え動物モデルの使用を制限することが多い、組織特異マーカーの使用を必要とせず純粋な萌芽期ティッシュの分離?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は原稿の批判的読解のイザベル Alcobia に感謝していますビデオ ナレーションの Mário エンリケスとセルバンテス ・ デ ・ Histologia e Biologia の組織サービスからビトー プロアは Desenvolvimento、Faculdade ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・ リスボアテクニカル サポートのためのパラナ ・ デ ・ リスボア。Faculdade ・ デ ・ Unidade ・ デ ・ audiovisuais (視聴覚ユニット) からサンパウロ Caeiro とヒューゴ ・ シルバに特にお世話になっておりますメディチーナ ・ デ ・ リスボア、このビデオの生産への顕著なコミットメントのパラナ ・ デ ・ リスボア。我々 は親切提供するビデオ システムと Interaves を装備した堅実ライカマイクロシス テムズ株式会社を認める – Sociedade 農業 Pecuária、ウズラに貢献してくれて S.A 受精卵。この作品は、Faculdade ・ デ ・によって支えられたメディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ de Lisboa (FMUL)。
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
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