Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus
Summary
Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo’s die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.
Abstract
De capaciteit om te isoleren van embryonale weefsels was een essentiële stap voor de vaststelling van de kwartel-kip chimera-systeem, dat op zijn beurt heeft verstrekt onbetwiste bijdragen aan de onthulling belangrijke processen in Ontwikkelingsbiologie.
Hierin is een geoptimaliseerde manier om zich te isoleren van embryonale weefsels van kwartels en kippen door microchirurgie en enzymatische spijsvertering met behoud van de biologische eigenschappen beschreven. Na isolatie, weefsels van beide soorten zijn met elkaar verbonden in een organotypic in vitro assay voor 48 h. kwartel en kip weefsels kunnen worden gediscrimineerd door verschillende nucleaire functies en moleculaire merkers waardoor de studie voor de cellulaire cross-talk tussen heterospecific vereniging van weefsels. Deze aanpak is dus een nuttig instrument voor de studie van interacties van de complexe weefsel in ontwikkelings processen met hoogdynamische ruimtelijke wijzigingen, zoals die welke voorkomen tijdens faryngaal genuitdrukking en de vorming van de voordarm Endoderm afkomstige organen. Deze experimentele aanpak was aanvankelijk ontwikkeld om te bestuderen van de epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van de formatie van de thymus. In de prospectieve serie grondbeginselen endoderm afkomstige en mesoderm afkomstige mesenchym, werden geïsoleerd van kwartel en kip embryo’s, respectievelijk.
De capaciteit van de omliggende weefsels tot organen kan verder te worden getest door ze te enten op het chorion membraan (CAM) van een embryo van de kip. De CAM biedt voedingsstoffen en gas uitwisseling aan het transplanteren weefsels. Na 10 dagen in ovo ontwikkeling, kunnen de chimeer organen in de geoogste explantaten door conventionele morfologische methodes worden geanalyseerd. Deze procedure staat ook weefsel-specifieke bijdragen tijdens orgel vorming, uit haar eerste ontwikkelen (in vitro) studeren de laatste fasen van de organogenese (in ovo ontwikkeling).
Tot slot, de verbeterde isolatie-methode biedt ook ruimtelijk (3D) bewaard embryonale weefsels, die kunnen ook worden gebruikt voor hoge resolutie topografische analyse van genexpressie-weefsel-specifieke patronen.
Introduction
In de vroege jaren 1970, werd een elegante kwartel-kip chimera-systeem ontwikkeld door Le Douarin, opening van nieuwe wegen om te begrijpen van de rol van cel migratie en cellulaire interacties tijdens ontwikkeling1,2. Het model is ontwikkeld op de vooronderstelling dat cel uitwisseling tussen de twee soorten embryogenese, later bevestigd wanneer gebruikt bij het bestuderen van tal van ontwikkelings processen, met inbegrip van de vorming van het zenuwstelsel en de hematopoietische niet aanzienlijk zou storen systemen1. De laatste als voorbeeld nemen, de cyclische golven van hematopoietische progenitorcellen koloniseren de serie epitheliale grondbeginselen werd het eerst waargenomen met behulp van de kwartel-kip chimera systeem3. Daarvoor was het toekomstige grondgebied van de zwezerik, de endoderm van de derde en vierde faryngaal zakjes (3/4PP), mechanisch en enzymatisch geïsoleerd van kwartel (q) embryo’s in 15 tot 30 – Somiet stadium [embryonale dag (E) 1.5-E2.5]. Deze fasen overeen met kip, Hamburger en Hamilton4 (HH) – fasen 12-17. De isolatie procedures gestart met het gebruik van tripsine enzymatisch verwerpen de endoderm uit de bijgevoegde mesenchym. De geïsoleerde endoderm was geënt op de somatopleura-regio van een embryo van de kip (c) host op E3-E3.5 (HH-etappes 20-21). Deze heterologe mesenchym werd beschouwd als “tolerant” serie epitheel ontwikkeling ook bijdragen aan de vorming van orgel3. Daarna opeenvolgende golven van kip host bloed overgedragen voorlopercellen geïnfiltreerd de kwartel donor serie epitheliale tegenhanger bij te dragen tot thymus vorming in de host embryo3.
Meer recentelijk, een gewijzigde versie van deze aanpak werd ook bewezen als belangrijk voor de studie van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van zwezerik vorming5. In dit opzicht waren de weefsels die betrokken zijn bij de vorming van de ectopische thymus in chimeer embryo’s3 geïsoleerd, zowel van de donor- en ontvangende embryo’s, en bijbehorende ex vivo. Een verbeterde protocol is gebruikt voor het isoleren van de kwartel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) en de kip somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale weefsels werden geïsoleerd door microchirurgie en onder voorbehoud van de in vitro Pancreatine spijsvertering. Ook werden de voorwaarden van enzymatische spijsvertering, temperatuur en tijd van incubatie geoptimaliseerd volgens weefseltype en ontwikkelingsstadium (tabel 1).
Vervolgens werden de geïsoleerde weefsels geassocieerd in een organotypic in vitro systeem voor 48 h, als eerder gemeld5,6. De in vitro vereniging van weefsels bootst de lokale cellulaire interacties in het embryo, het overwinnen van enkele beperkingen van de in vivo manipulatie. Dit systeem is met name nuttig zijn te onderzoeken van cellulaire interacties in complexe morfogenisch gebeurtenissen, zoals de ontwikkeling van het faryngaal apparaat.
De bijdrage van elk weefsel in de thymus histogenesis, alsmede het vermogen van de vereniging van de heterospecific voor het genereren van een thymus kan worden verder onderzocht met behulp van de CAM methodologie, eerder gedetailleerde5,7,8. Bondig, waren de gekweekte weefsels geënt op de nok van cE8 embryo’s en kunnen ontwikkelen in ovo voor 10 dagen. Thymus vorming werd vervolgens door morfologische analyse in de geoogste explantaten beoordeeld. Zoals in de klassieke studies van kwartel-kip3, werd de kwartel serie epitheel gekoloniseerd door hematopoïetische voorlopercellen (HPCs), afgeleid van het embryo van de kip, die later werd aangetoond bij te dragen tot orgel ontwikkeling9,10 . De HPCs migreerden vanuit het embryo aan de ectopische chimeer zwezerik tot en met de zeer gevacuoliseerd CAM5,7,–8. Kwartel afgeleide serie epitheel kan worden geïdentificeerd door immunohistochemistry met soortspecifieke antilichamen (dat wil zeggen, QCPN – MAb kwartel PeriNuclear), het overwinnen van de noodzaak van weefsel-specifieke moleculaire merkers.
Deze experimentele methode kunt als de aanpak in twee stappen gemeld in vorige publicatie8, u de modulering van de seingeving trajecten door regelmatige toediening van farmacologische agenten tijdens in vitro en in ovo ontwikkeling. Ook, explantaten geoogst kunnen worden op elk tijdstip van de cursus van het experiment8.
Tot slot, het protocol van de isolatie hier gedetailleerde staat het behoud van de natuurlijke eigenschappen en 3D-architectuur van embryonale weefsels, met name nuttig voor de detaillering ter plaatse van de genexpressie-patronen van embryonale gebieden anders ontoegankelijk door conventionele methoden. Transcriptome analyse benaderingen, met inbegrip van RNA-seq of microarrays, kunnen daarnaast ook worden toegepast in geïsoleerde weefsels zonder genetische tellers terwijl het verstrekken van een weefsel-specifieke hoge-doorvoer “omics” analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
De embryonale weefsels isolatie procedure hier is verbeterd van vorige technieken voor de productie van kwartel-kip chimeer embryo’s in verschillende biologische contexten3,5,6.
Deze aanpak is geschikt voor het isoleren van pure embryonale weefsels zonder genetische manipulatie of het gebruik van weefsel-specifieke markers, die vaak onbepaald zijn, beperking van het gebruik van genetisch gemodificeerd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn Isabel Alcobia dankbaar voor de kritische lezing van het manuscript, Mário Henriques voor video vertelling en Vitor Proa vanaf de betekening van de histologie van de Instituto de Histologia e Biologia doen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, voor technische ondersteuning. Wij zijn met name dank verschuldigd Paulo Caeiro en Hugo Silva uit de Unidade de audiovisuais (Unit audiovisuele media), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa voor hun uitstekende inzet voor de productie van deze video. Wij erkennen Leica Microsystems voor het vriendelijk het verstrekken van een stereoscoop uitgerust met een video systeem en Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A om bij te dragen met kwartel eieren bevrucht. Dit werk werd gesteund door Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
