Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu
Summary
Bu makalede embriyonik dokulardan saf formu ex vivo chimeric organları için bir araya getirilebilen bıldırcın ve tavuk embriyolar izole etmek için bir yöntem sağlar.
Abstract
Embriyonik Doku yalıtmak için kapasite sırayla gelişim biyolojisi örtüsünü açmak temel süreçleri tartışmasız katkılar sağlamıştır bıldırcın-tavuk chimera sistemi kurulması için önemli bir adım oldu.
Burada olduğunu bıldırcın ve Mikrocerrahi ve biyolojik özelliklerini koruyarak süre enzimatik sindirim tarafından tavuk embriyonik dokulardan yalıtmak için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi açıklanmıştır. Yalıtım sonra her iki tür dokulardan bir tüp bebek organotypic tahlil 48 h. bıldırcın için ilişkili ve tavuk dokuları farklı nükleer özellikleri ve moleküler işaretleyiciler hücresel çapraz konuşma arasında çalışma izin tarafından ayrımcılığa dokuların heterospecific Derneği. Bu yaklaşım, bu nedenle, karmaşık doku etkileşimleri gelişim süreçlerinde olanlar faringeal morfogenez ve foregut oluşumu sırasında meydana gelen gibi son derece dinamik uzamsal değişiklikler ile çalışmak için yararlı bir araçtır endoderm elde edilen organlar. Bu deneysel yaklaşım ilk mezenkimal epitel etkileşimleri erken-evrelerinde timus oluşumu incelemek için geliştirilmiştir. Bu, potansiyel timik rudiment endoderm kaynaklı ve Mezenşim mesoderm kaynaklı, sırasıyla bıldırcın ve tavuk embriyo izole edildi.
Organları oluşturmak için kapasite ilişkili dokuların daha fazla tavuk embriyo chorioallantoic membran (CAM) aşılama tarafından test edilecek. CAM besin sağlar ve explanted dokulara gaz alışverişi sağlar. Ovo geliştirme 10 gün sonra chimeric organ hasat explants geleneksel morfolojik yöntemlerle analiz edilebilir. Bu yordam ayrıca organogenesis (ovo gelişiminde) son dönemlerinde için ilk gelişimi (tüp bebek geliştirme) üzerinden organ oluşumu sırasında doku özgü katkıları eğitim verir.
Son olarak, geliştirilmiş yalıtım yöntemini sağlar ayrıca üç boyutlu (3D) doku özel gen ekspresyonu desenleri yüksek çözünürlüklü topografik analizi için de kullanılabilir embriyonik dokular, korunmuş.
Introduction
1970’lerin başında, bir zarif bıldırcın-tavuk chimera sistem Le Douarin, geliştirme1,2sırasında hücre göç ve hücresel etkileşimlerin rolünü anlamak için yeni yollar açma tarafından geliştirilmiştir. Hücre değişimi iki tür arasındaki önemli ölçüde embriyogenez, daha sonra gergin oluşumu ve hematopoetik dahil olmak üzere çok sayıda gelişimsel süreçleri çalışmaya kullanıldığında doğruladı rahatsız değil öncül modeli geliştirildi sistemleri1. İkinci örnek olarak alırsak, hematopoetik ataları timik epitel rudiment kolonize döngüsel dalgaları ilk gözlenen bıldırcın-tavuk chimera sistem3kullanarak. Bunun için timus, üçüncü ve dördüncü faringeal torbalar (3/4PP), endoderm aday bölge 15-30 – somite aşamada [embriyonik gün (E) 1.5-E2.5] bıldırcın (q) embriyo mekanik ve enzimatik izole edildi. Bu aşamalar tavuk Hamburger ve Hamilton4 (HH) – aşamaları 12-17 karşılık gelir. Yalıtım yordamlar tripsin enzimatik endoderm ekli Mezenşim dan ayırmak için kullanımı ile başladı. İzole endoderm ana tavuk (c) embriyo E3-E3.5 (SS-aşamaları 20-21), somatopleura bölgeye aşılı. Bu Contegra Mezenşim timik epitel gelişimine de katkıda organ oluşumu3‘ e “keyfi” olarak kabul edildi. Daha sonra art arda gelen dalgalar tavuk ev sahibi kan yoluyla progenitör hücrelerin ana bilgisayar embriyo3timus oluşumunda katkıda bulunmak ve bıldırcın donör timik epitel muadili sızmış.
Son zamanlarda, bu yaklaşım değiştirilmiş bir sürümü de erken-evrelerinde timus oluşumu5mezenkimal epitel etkileşimleri eğitimi için önemli olduğu kanıtlanmış oldu. Bu bağlamda, ektopik timus chimeric embriyo3 oluşumu dahil dokular, donör ve ana bilgisayar embriyolar, her ikisi de izole ve ex vivo ilişkili. Bıldırcın 3/4PP endoderm (E2.5-E3) ve tavuk somatopleura mesoderm (E2.5-E3) izole etmek için kullanılan gelişmiş bir protokol. Kısaca, embriyonik doku mikrocerrahi ve tüp bebek Pankreatin sindirim tabi izole edildi. Ayrıca, enzimatik sindirim, sıcaklığı ve süresi, kuluçka koşulları doku ve gelişimsel sahne (Tablo 1) göre optimize.
Ardından, izole dokular bir organotypic vitro sistemde 48 h, daha önce bildirilen5,6ilişkili. Tüp bebek derneğin dokuların içinde vivo manipülasyon bazı sınırlamalar üstesinden embriyo, yerel hücresel etkileşimlerde taklit eder. Bu sistem geliştirme faringeal cihazları gibi karmaşık morphogenic olaylarda hücresel etkileşimlerin çalışmaya özellikle yararlıdır.
Timus doku her dokusunda katkısını yanı sıra yetenek bir timus oluşturmak için heterospecific derneğin keşfedilmeyi kullanarak daha fazla CAM metodolojisi, daha önce ayrıntılı5,7,8olabilir. Kısaca, kültürlü dokulara cE8 embriyo CAM aşılı ve 10 gün boyunca ovo içinde geliştirmek için izin. O zaman, timus oluşumu hasat explants morfolojik analizi ile değerlendirilmiştir. Olduğu gibi klasik bıldırcın-tavuk çalışmalar3, bıldırcın timik epitel hematopoetik progenitör hücreler (HPCs) daha sonra organ gelişimi9‘ a,10 katkıda bulunmak için gösterildi tavuk embriyo elde tarafından kolonize . HPCs ile son derece bozukluklarına CAM5,7,8chimeric ektopik timus embriyo göç. Bıldırcın türetilmiş timik epitel doku özel moleküler işaretleyiciler ihtiyacını üstesinden species-specific antikorlar (yani, QCPN – MAb bıldırcın Perinükleer), kullanarak immünhistokimya belirlenebilir.
Bu deneysel Yöntem, önceki yayın8‘ de bildirilen iki aşamalı yaklaşım olarak sinyalleme yollarının modülasyonu düzenli yönetim sırasında tüp bebek ve ovo geliştirme farmakolojik ajanlar tarafından sağlar. Ayrıca, explants herhangi bir zaman-noktada deneme8tabii hasat edilebilir.
Son olarak, burada ayrıntılı yalıtım Protokolü doğal özellikleri korunması ve 3D-mimari embriyonik dokuların, aksi takdirde yerinde gen ekspresyonu desenleri embriyonik’in ayrıntılı için özellikle yararlı tarafından erişilemeyen sağlar geleneksel yöntemleri. Buna ek olarak, transcriptome analiz yaklaşımları, RNA-seq veya microarrays, dahil olmak üzere de izole dokularda bir doku özgü yüksek üretilen iş “omics” analiz sağlarken genetik işaretler gerek kalmadan uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada verilen embriyonik doku yalıtım yordam bıldırcın-tavuk chimeric bebekleri farklı biyolojik bağlamlarda3,5,6üretmek için önceki teknik geliştirildi.
Bu yaklaşım genetik manipülasyon veya belirsiz, genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri kullanımını sınırlama çoğu kez doku özgü işaretleri kullanımı gerektirmeden saf embriyonik doku yalıtmak uygundur. Mezenkimal epit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Isabel Alcobia için el yazması, eleştirel okuma için minnettarız yapmak video anlatımı için Mário Henriques ve Vitor Proa Instituto de Histologia e Biologia Histoloji hizmetinden Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, teknik destek için. Unidade de audiovisuais (görsel-işitsel birimi), Faculdade de Paulo Caeiro ve Hugo Silva için özellikle borçlu olduğumuzu Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa olağanüstü bağlılıklarını bu video üretimi için. Lütfen Interaves ve video sistemi ile donatılmış bir stereoscope sağlamak için Leica Microsystems anıyoruz – Sociedade Agro-Pecuária, S.A bıldırcın ile katkıda bulunmak için yumurta döllenmiş. Bu eser Faculdade de tarafından desteklenen Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
