الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية
Summary
موقع الموجه الطفرات أسلوب يستخدم لإدخال طفرات محددة في الحمض الخلوي الصبغي (DNA). هذا البروتوكول توضح كيفية القيام الطفرات الموجهة الموقع مع خطوة 2 والخطوة 3 تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على أساس النهج التي تنطبق على أي جزء من الحمض النووي للفائدة.
Abstract
موقع الموجه الطفرات تقنية تستخدم لإدخال طفرات محددة في الحمض النووي للتحقيق في التفاعل بين جزيئات الحمض النووي الريبي (سرنا) صغيرة غير الترميز والهدف رسول الكشف (مرناس). وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم الطفرات موقع الموجه لتعيين مواقع ربط بروتين محددة للجيش الملكي النيبالي. ويرد وصف عرضاً بكر على أساس الخطوة 2 والخطوة 3 للطفرات. والنهج ذات الصلة لجميع البروتين-الجيش الملكي النيبالي ودراسات الحمض النووي الريبي الريبي التفاعل. وباختصار، هذه التقنية تعتمد على تصميم كبسولة تفجير mutation(s) المنشودة، ومن خلال الخطوات 2 أو 3 من PCR توليف منتج PCR مع الطفرة. ثم يتم استخدام المنتج PCR للاستنساخ. وهنا، نحن تصف كيفية تنفيذ الطفرات الموجهة الموقع مع كل نهج الخطوة 2 و 3 استحداث الطفرات سرنا و McaS ومرناً، كسجد، للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي-الجيش الملكي النيبالي وتفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي. نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي التفاعلات؛ هذا الأسلوب غير المنطبقة على جميع الدراسات الطفرات (مثل التفاعلات الحمض النووي عالي البروتين، والأحماض الأمينية بالإضافة/الحذف/استبدال). من الممكن إدخال أي نوع من الطفرة باستثناء القواعد غير طبيعية ولكن هذا الأسلوب لا ينطبق إلا إذا كان يمكن استخدام منتج PCR المصب بالتطبيق (مثل الاستنساخ وقالب لمزيد من PCR).
Introduction
الحمض النووي كثيرا ما يشار إلى خطة لخلية حية حيث يتم ترميز جميع الهياكل الخلية في تسلسل الحمض النووي لها. النسخ المتماثل دقيقة وآليات إصلاح الحمض النووي ضمان حدوث معدلات منخفضة جداً فقط من الطفرات، هو أمر ضروري للحفاظ على الوظائف الصحيحة للجينات مشفرة. تغيير تسلسل الحمض النووي يمكن أن يؤثر على الوظائف المتعاقبة على مستويات مختلفة بدءاً من الحمض النووي (الاعتراف بعوامل النسخ والتقييد الإنزيمات)، ثم الجيش الملكي النيبالي (تكامل قاعدة بين زوج وتعديلات الهيكل الثانوي) و/أو البروتين (الأمينية استبدال حمض والحذف والإضافات أو الإطار-التحولات). في حين أن العديد من الطفرات لا تؤثر على وظيفة المورثات إلى حد كبير، يمكن أن يكون بعض طفرات في الحمض النووي آثار ضخمة. وهكذا، الطفرات الموجهة من الموقع أداة قيمة لدراسة أهمية مواقع محددة من الحمض النووي على جميع المستويات.
ويصف هذا البروتوكول نهجاً الطفرات مستهدفة تستخدم لإدخال طفرات محددة. يعتمد البروتوكول على استراتيجيتين PCR مختلفة: 2-خطوة أو بكر 3-الخطوة. بكر 2-الخطوة قابلاً للتطبيق إذا كانت الطفرة المنشودة بالقرب من النهاية 5 ‘أو نهاية 3’ الحمض النووي للفائدة (< 200 زوج قاعدي (bp) من النهاية) وبكر 3-الخطوة قابلاً للتطبيق في جميع الحالات.
في نهج بكر الخطوة 2، كبسولة تفجير 3 مصممة الذي صمم مجموعة واحدة من الإشعال تضخيم الحمض النووي للفائدة (كبسولة تفجير 1 و 3، إلى الأمام وعكس، على التوالي) وكتاب واحد يهدف إلى إدماج الطفرة. الطفرة إدخال التمهيدي (التمهيدي 2) ينبغي أن يكون اتجاه عكس إذا كانت الطفرة القريبة من النهاية 5 ‘وتوجه إلى الأمام إذا كانت الطفرة بالقرب من النهاية 3’. في الخطوة الأولى في بكر، يسهب التمهيدي 1 + 2 أو 2 + 3 جزء صغيرة قريبة من 5 ‘نهاية أو 3’ نهاية، على التوالي. ثم يتم استخدام ناتج PCR تمهيدي في الخطوة الثانية مع التمهيدي 1 أو 3، مما أدى إلى منتج PCR مع طفرة في الحمض النووي للفائدة (الشكل 1A).
في PCR الخطوة 3، يتم تصميم كبسولة تفجير 4، الذي صمم مجموعة واحدة من الإشعال تضخيم الحمض النووي للفائدة (كبسولة تفجير 1 و 4، إلى الأمام وعكس، على التوالي) ومجموعة واحدة من الإشعال يهدف إلى إدماج طفرات محددة مع تداخل التكامل (2 و 3، عكس والي الأمام، على التوالي). في خطوة واحدة، واثنتان، وتضخيم الإشعال 1 + 2 و 3 + 4 في نهاية 5 ‘و 3’. في الخطوة الثالثة، منتجات PCR الناتجة من خطوة واحدة واثنين يتم استخدامها كقوالب وتضخيم مع الإشعال 1 + 4. وهكذا، من بكر وناتج الحمض النووي للفائدة مع الطفرة المرجوة (الشكل 1B).
بينما يمكن استخدام الحمض النووي تحور لأي تطبيق المصب، يصف هذا البروتوكول كيفية إعادة دمج الحامض النووي في ناقل استنساخ. استخدام استنساخ متجهات مزايا عديدة مثل سهولة الاستنساخ وتطبيقات تجريبية محددة تبعاً لميزات ناقل. غالباً ما يتم استخدام هذه الميزة لدراسات التفاعل الجيش الملكي النيبالي. أسلوب آخر للحمض النووي الريبي دراسات التفاعل سبر الهيكلية للجيش الملكي النيبالي في المجمع مع آخر الجيش الملكي النيبالي1،2 أو البروتين3،4. ومع ذلك، الهيكلي هو فقط إجراء التدقيق في المختبر حين الطفرات موقع الموجه والاستنساخ اللاحقة تسمح بالتفاعل الدراسات المجراة.
الطفرات موقع الموجه قد استخدمت على نطاق واسع للجيش الملكي النيبالي التفاعل الدراسات كما عرضها هنا. بيد أن الأسلوب الرئيسية بشأن 2 أو 3-خطوة PCR تنطبق على أي قطعة من الحمض النووي وهكذا لا يقتصر على دراسات الحمض النووي الريبي-التفاعل.
لتجسيد هذه التقنية واستخداماتها المحتملة، يتم استخدام الوصف لمناطق هامة لتنظيم بوستترانسكريبشونال مرناً، كسجد، من الإشريكيّة القولونية (كولاي). كولاي، كسجد هو استهداف قبل الصغيرة غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، McaS، بالتعاون مع بروتين، هفق، لقمع التعبير البروتين كسجد2،،من45. التقنية تستخدم لإدخال طفرات إلى منطقة قاعدة المزاوجة بين كسجد و McaS، وموقع الربط هفق كسجد. ثم هو استنساخ الحمض النووي التي تم الحصول عليها إلى ناقل مناسب للتجارب اللاحقة. وتشمل التطبيقات المصب تقنية التجارب المجراة في سواء في المختبر. للتوضيح، مثال 1 تتميز المجراة باستخدام تحليل لطخة غربية وتتميز المثال 2 في المختبر باستخدام مقايسة تحول تنقل الغرواني الكهربي (أمسا). وفي كلتا الحالتين الطفرات يتضح كيفية توجيه الموقع يمكن استخدامها بالاقتران مع غيرها من تقنيات جعل استنتاجات البيولوجية حول جينات للفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
موقع الموجه الطفرات مجموعة واسعة من التطبيقات المختلفة، وهنا، أدرجت نتائج الممثل من المجراة في وتجربة في المختبر كأمثلة على كيفية جعل استنتاجات البيولوجية باستخدام هذه التقنية. وقد الطفرات الموجهة من موقع لفترة طويلة المعيار الذهبي لدراسات تفاعل الحمض النووي الريبي. وتكمن قوة هذه التقن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر جامعة جنوب الدنمارك الوصول المفتوح سياسة المنح.
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
