Mutagenèse dirigée pour In Vitro et In Vivo des expériences illustrées avec Interactions ARN chez Escherichia Coli
Summary
Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ce protocole décrit comment faire mutagénèse dirigée avec un 2-step et approche, qui s’applique à n’importe quel fragment d’ADN d’intérêt basée sur les 3 étapes amplification génique (PCR).
Abstract
Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’ADN d’étudier l’interaction entre les petites molécules d’acide ribonucléique (sRNA) non codantes et cibles ARN de messager (ARNm). En outre, mutagénèse dirigée est utilisé pour mapper des sites de liaison protéine spécifique à l’ARN. Une introduction de PCR basé étapes 2 et 3 étapes de mutations est décrite. L’approche est pertinente aux études sur les interactions ARN-ARN et protéine-ARN. En bref, la technique s’appuie sur la conception des amorces avec le mutation(s) désiré et 2 ou 3 étapes de la PCR synthétiser un produit PCR avec la mutation. Le produit PCR est ensuite utilisé pour le clonage. Nous décrivons ici comment effectuer la mutagenèse dirigée, avec les deux celle de 2 et 3 pas à introduire des mutations la sRNA, AMC et l’ARNm, Cdgs, d’enquêter sur les ARN-ARN et interactions ARN-protéine. Nous appliquons cette technique pour étudier les interactions de RNA ; Cependant, cette technique est applicable à toutes les études de mutagenèse (interactions ADN-protéines, acides aminés remplacement/suppression/ajout). Il est possible d’introduire n’importe quel genre de mutation à l’exception des bases non naturelle, mais la technique n’est applicable que si un produit PCR peut être utilisé pour une application en aval (par exemple, le clonage et le modèle pour plus de PCR).
Introduction
ADN est souvent appelée le plan d’action d’une cellule vivante puisque toutes les structures de la cellule sont encodés dans la séquence de son ADN. La réplication exacte et les mécanismes de réparation de l’ADN s’assurer que seules de très faibles taux de mutations se produisent, qui est essentiel pour maintenir les fonctions correctes des gènes codés. Modifications de la séquence d’ADN peuvent affecter les fonctions successives à différents niveaux de départ avec l’ADN (reconnaissance de facteurs de transcription et les enzymes de restriction), puis RNA (complémentarité des paires de bases et des altérations de la structure secondaire) ou autres protéines (amino substitutions de l’acides, destructions, additions ou cadre-déplacements). Nombreuses mutations n’affectent pas la fonction du gène considérablement, certaines mutations dans l’ADN peuvent avoir des conséquences considérables. Ainsi, la mutagenèse dirigée est un outil précieux pour l’étude de l’importance des sites spécifiques de l’ADN à tous les niveaux.
Ce protocole décrit une approche de mutagenèse ciblée utilisée pour introduire des mutations spécifiques. Le protocole s’appuie sur deux stratégies différentes de PCR : un 2-step ou un PCR de 3 étapes. La PCR 2 étapes s’applique si la mutation souhaitée se trouve à proximité de l’extrémité 5′ ou de l’extrémité 3′ de l’ADN d’intérêt (< 200 paires de bases (bp) de la fin) et la PCR 3 étapes s’applique dans tous les cas.
Dans l’approche PCR étapes 2, 3 amorces sont conçus, dans lequel une série d’amorces est conçue pour amplifier l’ADN d’intérêt (amorces 1 et 3, avance et retour, respectivement), et une amorce unique est conçue pour incorporer la mutation. La mutation introduction d’apprêt (primer 2) devrait avoir une orientation inverse, si la mutation se trouve à proximité de l’extrémité 5′ et une orientation vers l’avant si la mutation se trouve à proximité de l’extrémité 3′. Dans la première étape de la PCR, primer 1 + 2 ou 2 + 3 amplifie un petit fragment à proximité de l’extrémité 5′ ou 3′ fin, respectivement. Le produit PCR qui en résulte sert ensuite comme une amorce dans la deuxième étape avec l’apprêt 1 ou 3, résultant ainsi en un produit PCR avec une mutation de l’ADN d’intérêt (Figure 1 a).
Pour l’ACP de 3 marches, 4 amorces sont conçus, dont une série d’amorces est conçue pour amplifier l’ADN d’intérêt (amorces 1 et 4, avant et arrière, respectivement) et une série d’amorces est conçue pour incorporer des mutations spécifiques qui se chevauchent de complémentarité (amorces 2 et 3, marche arrière et avant, respectivement). À l’étape un et deux, amorces 1 + 2 et 3 + 4 amplifient l’extrémité 5′ et 3′. Dans la troisième étape, les produits PCR obtenus de l’étape 1 et deux sont utilisés comme modèles et amplifié avec des amorces 1 + 4. Ainsi, le produit PCR qui en résulte est l’ADN d’intérêt avec la mutation désirée (Figure 1 b).
Alors que l’ADN muté peut être utilisé pour n’importe quelle application en aval, ce protocole décrit comment re-combiner l’ADN dans un vecteur de clonage. L’utilisation de vecteurs de clonage présente plusieurs avantages comme la facilité du clonage et des applications expérimentales spécifiques selon les caractéristiques du vecteur. Cette fonctionnalité est souvent utilisée pour les études d’interactions RNA. Une autre technique pour les études d’interactions RNA est sonder structurelle de l’ARN en complexe avec un autre ARN1,2 ou protéine3,4. Cependant, sondant structurelle est uniquement effectuée in vitro tandis que mutagénèse dirigée et le clonage à des fins ultérieures permettent pour les études d’interactions in vivo.
Mutagenèse dirigée a été largement utilisé pour les études d’interactions RNA tel que présenté ici. Toutefois, la principale méthode PCR sur 2 ou 3 pas s’applique à n’importe quel fragment d’ADN et donc pas seulement limité à études d’interaction de l’ARN.
Pour illustrer la technique et ses utilisations possibles, caractérisation des régions importantes pour la régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm, Cdgs, d’ Escherichia coli (e. coli) est utilisée. Dans e. coli, Cdgs sont ciblés par le petits ARN non codants, McaS, en coopération avec une protéine, la Hfq, de réprimer l’expression de la protéine de Cdgs2,4,5. La technique est utilisée pour introduire des mutations dans la région d’appariement entre Cdgs et McaS et sur le site de liaison de Hfq de csgD. L’ADN obtenu est ensuite cloné dans un vecteur approprié pour les expériences ultérieures. Applications en aval de la technique comprennent des expériences in vivo et in vitro. À titre d’illustration, exemple 1 est caractérisée in vivo utilisant une analyse par transfert western et exemple 2 se caractérise in vitro en utilisant une analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA). Dans les deux cas, il est illustré de mutagénèse comment dirigée peut être utilisé en combinaison avec d’autres techniques de tirer des conclusions biologiques sur un gène d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenèse dirigée a un large éventail d’applications différentes, et ici, les résultats représentatifs d’un in-vivo et une expérience in vitro ont été inclus comme exemples de la façon de tirer des conclusions biologiques à l’aide de la technique. Mutagenèse dirigée a longtemps été la méthode de référence pour les études d’interactions RNA. La force de la technique réside dans la combinaison de l’introduction de mutations pertinentes avec des dosages en aval et expériences (p. ex., la tach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier les subventions de la politique de libre accès University of Southern Denmark.
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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