מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Summary

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

Abstract

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג ספציפי מוטציות ב- DNA כדי לחקור את האינטראקציה בין מולקולות חומצה ריבונוקלאית (sRNA) קטנות ללא קידוד RNAs שליח היעד (mRNAs). בנוסף, מוטגנזה משמש כדי למפות אתרי קישור ספציפי חלבון ה-RNA. הקדמה PCR המבוסס על שלבים 2 ו- 3-צעד של מוטציות מתואר. הגישה היא רלוונטי כל חלבון-RNA ולימודי אינטראקציה RNA-RNA. בקיצור, השיטה מסתמכת על עיצוב תחל עם mutation(s) הרצויה, 2 או 3. הצעדים של ה-PCR סינתזה של מוצר ה-PCR עם המוטציה. המוצר PCR משמש לאחר מכן לקראת שיבוט. כאן, אנו נתאר כיצד לבצע מוטגנזה עם הגישה 2 - ו 3-צעד שני להציג מוטציות של sRNA, McaS של ה-mRNA, csgD, לחקור RNA-RNA ו- RNA חלבונים. אנו מיישמים את הטכניקה הזו לחקור אינטראקציות RNA; עם זאת, השיטה היא החלים על כל לימודי מוטגנזה מכוונת (למשל, אינטראקציות חלבון-דנ א, חומצה אמינית החלפת/מחיקה/הוספה). ניתן להציג כל סוג של מוטציה חוץ בסיסים הלא טבעי אבל הטכניקה ישימה רק אם מוצר ה-PCR יכול לשמש עבור יישום במורד הזרם (למשל, שיבוט, תבנית נוספת PCR).

Introduction

הדנ א הוא המכונה לעתים קרובות ה-blueprint של תא חי מאז מבני התא מקודדים את רצף ה-DNA שלו. שכפול מדויק מנגנוני תיקון DNA על מנת להבטיח כי רק מאוד נמוכים של מוטציות מתרחשות, שהוא חיוני לקיום פונקציות הנכון של גנים מקודד. שינויים של רצף הדנ א יכול להשפיע על פונקציות רציפות ברמות שונות החל עם ה-DNA (זיהוי על-ידי גורמי שעתוק, אנזימי הגבלה), ואז RNA (זוג בסיסים משלימים את החסר והשינויים מבנה שניוני) ו/או חלבון (אמינו החלפות חומצה, מחיקות, תוספות או מסגרת-משמרות). בעוד מוטציות רבות אינן משפיעות על תפקוד הגן באופן משמעותי, יש מוטציות ב- DNA יכולים להיות השלכות ענקיות. לפיכך, מוטגנזה הוא כלי רב ערך עבור לומד את החשיבות של אתרים DNA ספציפיים בכל הרמות.

Protocol

1. וקטור בחירה

1. לבחור וקטור לבצע ניסויים במורד הזרם. כל וקטור הוא ישים עבור שיטה זו PCR 2 - ו 3-צעד.
2. בהתבסס על הבחירה של וקטור, לבחור אנזימי הגבלה המתאים עבור שכפול.

2. פריימר עיצוב עבור אתר ביים מוטגנזה מכוונת

1. להחליט בכל שלב 2 או 3-צעד PCR האסטרטגיה (2-שלב זה רק עבור מוטציות < 200 bp מקצה ה-dna של עניין). עבור PCR דו-שלבי, עבור לשלב 2.2 וללכת על ה-PCR 3-צעד צעד 2.3.
2. עיצוב צבעי יסוד 2-שלב ה-PCR.
   1. עיצוב פריימר 1 ו- 3 כדי להגביר את ה-DNA של עניין ועם של 5' בולט זה מכיל נוקלאוטידים 4 (למשל, האישיות של או AGCT) ואחריו האתר זיהוי הגבלת הרלוונטי הדרוש לשבט לתוך הווקטור שבחרת.
   2. עיצוב פר....

Results

לחקור RNA אינטראקציות מנשר post-transcriptional של csgD, מלכודת וקטור זוגי נבחר: אחד לבטא את csgD mRNA ועוד לבטא את קטן ללא קידוד RNA, McaS. csgD היה משובטים לתוך pBAD33, אשר הוא אראבינוז, inducible פלסמיד בינוני-העתק בהתנגדות כלורמפניקול, McaS היה משובטים לתוך מיני pNDM220 R1, אשר הוא פלסמיד inducible עותק נמוך איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) עם אמפיצילין ההתנגדות. פראי סוג csgD היה PCR מוגבר באמצעות תחל 1A ו- 4A (4A כולל דגל-רצף) להניב P.......

Discussion

מוטגנזה יש מגוון רחב של יישומים שונים, כאן, התוצאות נציג של ויוו, ניסוי המבחנה נכללו בתור דוגמאות כיצד להפוך את מסקנות ביולוגי בטכניקה. מוטגנזה כבר זמן רב תקן הזהב ללימודי אינטראקציה RNA. כוחה של השיטה טמון השילוב של היכרות עם מוטציות הרלוונטיים עם מבחני במורד הזרם, ניסויים (למשל, תספיג או EMSA) כדי להסיק מסקנות לגבי אתרים DNA ספציפיים וחשיבותן בפונקציות ג'ין-מוצרים שאלה. כאשר אתה מחליט לעשות מוטגנזה, העיצוב של צבעי בסיס צריך להיות תכננה בקפדנות כדי להשיג את המרב של הטכניקה (למשל אילו אתרים להפוך למוטציות); הקפד נמנים המ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
נוגדן Anti-GroEL המיוצר בארנב	Merck	G6532	נוגדן ראשוני
Azure c200	Azure	NA	Gel הדמיית תחנת עבודה
מותאמת אישית DNA	oligo Merck	VC00021
DeNovix DS-11	DeNovix	NA	ספקטרופוטומטר למדידות חומצות גרעין
DNA ג'ל טעינת צבע (6X)	Thermo Scientific	R0611
תמיסת אתידיום ברומיד 1	קארל רוט	2218.1
ערכת מיצוי ג'ל GeneJET	Thermo Scientific	K0691
GeneRuler DNA סולם תערובת	תסיסה	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi Gerard	Biotech	TO12	צינורות דיאליזה לפליטה אלקטרו
MEGAscript T7 ערכת תמלול	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-Rad	1704406	מערכת אלקטרופורזה אופקית
נוגדן חד-שבטי ANTI-FLAG M2 המיוצר בעכבר	Merck	F3165	נוגדן ראשוני
אימונוגלובולינים של עכבר	Dako Cytomation	P0447	HRP נוגדן משני מצומד
NucleoSpin miRNA	Macherey Nagel	740971	טיהור RNA
NuPAGE 4-12% Bis-Tris ג'לי חלבון	Thermo Scientific	NP0323BOX	Bis-Tris ג'לים להפרדת חלבונים
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix עם HF Buffer	ניו אינגלנד Biolabs	M0531S	DNA פולימראז
PowerPac HC ספק כוח זרם גבוה	Bio-Rad	1645052
ארנב אימונוגלובולינים	Dako Cytomation	P0448	HRP מצומד נוגדן משני
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	כלי תוכנה לניתוח גרפים ונתונים
T100 Thermal	Cycler Bio-Rad		1861096 PCR מכונת T4
DNA ligase	ניו אינגלנד Biolabs	M0202	Ligase
T4 פולינוקלאוטיד Kinase	ניו אינגלנד Biolabs	M0201S
חוצץ TAE (Tris-אצטט-EDTA) (50X)	Thermo Scientific	B49