מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli
Summary
מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.
Abstract
מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג ספציפי מוטציות ב- DNA כדי לחקור את האינטראקציה בין מולקולות חומצה ריבונוקלאית (sRNA) קטנות ללא קידוד RNAs שליח היעד (mRNAs). בנוסף, מוטגנזה משמש כדי למפות אתרי קישור ספציפי חלבון ה-RNA. הקדמה PCR המבוסס על שלבים 2 ו- 3-צעד של מוטציות מתואר. הגישה היא רלוונטי כל חלבון-RNA ולימודי אינטראקציה RNA-RNA. בקיצור, השיטה מסתמכת על עיצוב תחל עם mutation(s) הרצויה, 2 או 3. הצעדים של ה-PCR סינתזה של מוצר ה-PCR עם המוטציה. המוצר PCR משמש לאחר מכן לקראת שיבוט. כאן, אנו נתאר כיצד לבצע מוטגנזה עם הגישה 2 – ו 3-צעד שני להציג מוטציות של sRNA, McaS של ה-mRNA, csgD, לחקור RNA-RNA ו- RNA חלבונים. אנו מיישמים את הטכניקה הזו לחקור אינטראקציות RNA; עם זאת, השיטה היא החלים על כל לימודי מוטגנזה מכוונת (למשל, אינטראקציות חלבון-דנ א, חומצה אמינית החלפת/מחיקה/הוספה). ניתן להציג כל סוג של מוטציה חוץ בסיסים הלא טבעי אבל הטכניקה ישימה רק אם מוצר ה-PCR יכול לשמש עבור יישום במורד הזרם (למשל, שיבוט, תבנית נוספת PCR).
Introduction
הדנ א הוא המכונה לעתים קרובות ה-blueprint של תא חי מאז מבני התא מקודדים את רצף ה-DNA שלו. שכפול מדויק מנגנוני תיקון DNA על מנת להבטיח כי רק מאוד נמוכים של מוטציות מתרחשות, שהוא חיוני לקיום פונקציות הנכון של גנים מקודד. שינויים של רצף הדנ א יכול להשפיע על פונקציות רציפות ברמות שונות החל עם ה-DNA (זיהוי על-ידי גורמי שעתוק, אנזימי הגבלה), ואז RNA (זוג בסיסים משלימים את החסר והשינויים מבנה שניוני) ו/או חלבון (אמינו החלפות חומצה, מחיקות, תוספות או מסגרת-משמרות). בעוד מוטציות רבות אינן משפיעות על תפקוד הגן באופן משמעותי, יש מוטציות ב- DNA יכולים להיות השלכות ענקיות. לפיכך, מוטגנזה הוא כלי רב ערך עבור לומד את החשיבות של אתרים DNA ספציפיים בכל הרמות.
פרוטוקול זה מתאר גישה מוטגנזה מכוונת יישוב נוהג להציג מוטציות ספציפיות. הפרוטוקול מסתמכת על שתי אסטרטגיות שונות של ה-PCR: צעד 2 או של PCR 3-צעד. 2-שלב ה-PCR ישימה אם המוטציה הרצוי קרוב בקצה 5′ או 3′ הסוף של ה-DNA של הריבית (< 200 בסיסי זוגות (bp) מסוף) ואת ה-PCR 3-צעד ישימה בכל המקרים.
בגישה PCR דו-שלבי, תחל 3 מיועדים שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 3, קדימה, הפוך, בהתאמה), יחיד פריימר נועדה לשלב את המוטציה. המוטציה היכרות עם פריימר (פריימר 2) צריך להיות כיוון הפוך, אם המוטציה קרוב לסוף 5′, כיוון קדימה אם המוטציה קרוב בקצה 3′. בשלב הראשון PCR, פריימר 1 + 2 או 3 2 + מגביר קטע קטן קרוב 5′ קצה או 3′ בסוף, בהתאמה. PCR ובמוצר משמשת פריימר בשלב שתיים עם פריימר 1 או 3, ובעקבותיה במוצר ה-PCR עם מוטציה ב- DNA של עניין (איור 1 א’).
ב- PCR 3-צעד, תחל 4 מיועד, שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 4, קדימה, הפוך, בהתאמה), סט צבעי יסוד אחד נועדה לשלב מוטציות ספציפיות עם חופפים משלימים את החסר (תחל 2 ו- 3, הפוך, קדימה, בהתאמה). בשלב הראשון והשני, תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 להגביר בקצה 5′ ו 3′. בשלב 3, מוצרי ה-PCR וכתוצאה מכך צעד ראשון, שני משמשים כתבניות ומצויים מוגבר עם תחל 1 + 4. לכן, ובמוצר PCR הוא ה-DNA של עניין עם המוטציה הרצוי (איור 1B).
בעוד ה-DNA מוטציה יכול לשמש עבור כל יישום במורד הזרם, פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב את הדנ א מחדש לתוך השיבוט וקטור. השימוש של שיבוט וקטורים יש מספר יתרונות כגון הקלות של שכפול ויישומים ספציפיים ניסיוני תלוי בתכונות של וקטור. תכונה זו משמשת לעתים קרובות ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA. טכניקה נוספת ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA היא חיטוט מבנית של הרנ א במתחם עם עוד RNA1,2 או חלבון3,4. עם זאת, חיטוט מבניים מבוצעת רק במבחנה ואילו מוטגנזה ו שיבוט עוקבות לאפשר ללימודי אינטראקציה ויוו.
מוטגנזה בהרחבה שימש לחקר אינטראקציה RNA כפי שהוצג כאן. עם זאת, שיטת המפתח לגבי 2 או 3-צעד PCR החלים על כל פיסת דנ א, ובכך לא רק מוגבל ללימודים RNA-אינטראקציה.
כדי להדגים את הטכניקה ואת השימושים האפשריים שלו, משמש אפיון אזורי חשוב post-transcriptional ויסות mRNA, csgD, של Escherichia coli (e. coli). ב e. coli, csgD מכוון על ידי קטן ללא קידוד RNA, McaS, בשיתוף עם חלבון, Hfq, להדחיק חלבון-ביטוי של4,2,CsgD5. הטכניקה משמשת כדי להציג מוטציות באזור בסיס תיאום בין csgD לבין McaS, לאתר איגוד Hfq של csgD. ה-DNA שהושג לאחר מכן שוכפל לתוך וקטור מתאים לניסויים הבאים יישומים במורד הזרם של הטכניקה כוללים ניסויים במבחנה וגם ויוו. להמחשה, דוגמה 1 מאופיין ויוו שימוש assay תספיג והוא דוגמה 2 מאופיין במבחנה באמצעות assay משמרת של ניידות electrophoretic (EMSA). בשני המקרים, זה מאויר איך מוטגנזה יכול לשמש בשילוב עם טכניקות אחרות כדי להפוך ביולוגי מסקנות לגבי הגן עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
מוטגנזה יש מגוון רחב של יישומים שונים, כאן, התוצאות נציג של ויוו, ניסוי המבחנה נכללו בתור דוגמאות כיצד להפוך את מסקנות ביולוגי בטכניקה. מוטגנזה כבר זמן רב תקן הזהב ללימודי אינטראקציה RNA. כוחה של השיטה טמון השילוב של היכרות עם מוטציות הרלוונטיים עם מבחני במורד הזרם, ניסויים (למשל, תספיג או EMSA)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות באוניברסיטת דרום דנמרק גישה פתוחה מדיניות מענקים.
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
