Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Summary

Site-directed mutagenese er en teknik, der anvendes til at indføre specifikke mutationer i deoxyribonukleinsyre (DNA). Denne protokol beskriver, hvordan at gøre site-directed mutagenese med en 2-trins og 3-trins Polymerasekædereaktionen (PCR) baseret tilgang, der finder anvendelse på enhver DNA fragmenter af interesse.

Abstract

Site-directed mutagenese er en teknik, der anvendes til at indføre specifikke mutationer i DNA til at undersøge samspillet mellem små ikke-kodende ribonukleinsyre (sRNA) molekyler og target messenger RNA’er (mRNAs). Desuden, bruges site-directed mutagenese til at knytte specifikke protein bindingssteder til RNA. En 2-trins og 3-trins PCR baseret indførelsen af mutationer er beskrevet. Metoden er relevant for alle protein-RNA og RNA-RNA interaktion undersøgelser. Kort sagt, afhængig teknikken design primere med den ønskede mutation(s), og gennem 2 eller 3 trin af PCR syntetisere en PCR produkt med mutationen. PCR-produktet bruges derefter til kloning. Vi beskriver her, hvordan du udfører site-directed mutagenese med både 2 – og 3-trins tilgang til at indføre mutationer af sRNA, McaS og mRNA, csgD, at undersøge RNA-RNA og RNA-protein interaktioner. Vi anvender denne teknik for at undersøge RNA interaktion; teknikken er dog gældende for alle mutagenese undersøgelser (fx DNA-protein interaktioner, aminosyre substitution/sletning/tilføjelse). Det er muligt at indføre nogen form for mutation bortset fra ikke-naturlige baser, men teknikken er kun gældende, hvis en PCR produkt kan bruges til efterfølgende anvendelse (fx, kloning og skabelon for yderligere PCR).

Introduction

DNA er ofte omtales som blueprint af en levende celle, da alle strukturer i cellen er kodet i rækkefølgen af sit DNA. Nøjagtig replikering og DNA reparation mekanismer sikre, at kun meget lave takster for mutationer opstår, som er afgørende for at opretholde korrekte funktioner af kodede gener. Ændringer i DNA-sekvens kan påvirke hinanden følgende funktioner på forskellige niveauer, startende med DNA (anerkendelse af transkriptionsfaktorer og restriktionsenzymer), derefter RNA (base-pair komplementaritet og sekundær struktur ændringer) og/eller protein (aminosyrer syre erstatninger, udeladelser, tilføjelser eller ramme-Skift). Mens mange mutationer ikke påvirker genfunktion betydeligt, kan nogle mutationer i DNA har enorme konsekvenser. Således, site-directed mutagenese er et værdifuldt redskab til at studere betydningen af specifikke DNA websteder på alle niveauer.

Denne protokol beskriver en målrettet mutagenese fremgangsmåde bruges til at indføre specifikke mutationer. Protokollen er baseret på to forskellige PCR strategier: en 2-trins eller en 3-trins PCR. 2-trins PCR er gældende, hvis den ønskede mutation er tæt på enten 5′-enden eller 3′-enden af DNA af interesse (< 200 basepar (bp) fra slutningen) og 3-trins PCR kan anvendes i alle tilfælde.

I 2-trins PCR tilgang, 3 primere er designet, hvor ét sæt primere er designet til at forstærke DNA af interesse (primere 1 og 3, frem og bak, henholdsvis), og en enkelt primer er udviklet til at inkorporere mutationen. Mutationen at indføre primer (primer 2) bør have en omvendt orientering, hvis mutationen er tæt på 5′-enden og et fremadrettet retning hvis mutationen er tæt på 3′-enden. I det første skridt i PCR forstærker primer 1 + 2 eller 2 + 3 et lille fragment tæt på 5′ enden eller 3′ enden, henholdsvis. Den resulterende PCR produkt bruges derefter som en primer i trin to med primer 1 eller 3, hvilket resulterer i en PCR produkt med en mutation i DNA af interesse (figur 1A).

I 3-trins PCR, 4 primere er designet, hvor ét sæt primere er designet til at forstærke DNA af interesse (primere 1 og 4, frem og bak, henholdsvis) og ét sæt primere er udviklet til at inkorporere bestemte mutationer med overlappende komplementaritet (primere 2 og 3, vende og fremad, henholdsvis). I trin et og to, primere 1 + 2 og 3 + 4 forstærke 5′ og 3′ enden. I trin tre, de deraf følgende PCR produkter fra trin et og to er brugt som skabeloner og forstærket med primere 1 + 4. Den resulterende PCR produkt er således DNA af interesse med den ønskede mutation (figur 1B).

Mens muteret DNA kan bruges til enhver downstream, beskriver denne protokol, hvordan du re kombinere DNA i en kloning vektor. Anvendelse af kloning vektorer har flere fordele som brugervenlighed kloning og særlige eksperimentelle programmer afhængigt af funktioner af vektoren. Denne funktion anvendes ofte til RNA interaktion undersøgelser. En anden teknik til RNA interaktion undersøgelser er strukturelle sondering af RNA i kompleks med en anden RNA^1,2 eller protein^3,4. Imidlertid udføres strukturelle sondering kun in vitro-mens site-directed mutagenese og efterfølgende kloning mulighed for interaktion undersøgelser in vivo.

Site-directed mutagenese har været flittigt brugt til RNA interaktion undersøgelser, som præsenteres her. Imidlertid den vigtigste metode med hensyn til 2 – eller 3-trins PCR gælder for ethvert stykke DNA, og derfor ikke kun begrænset til RNA-interaktion undersøgelser.

For at illustrere teknikken og dens anvendelsesmuligheder, bruges karakterisering af regioner vigtigt for post-transcriptional regulering af mRNA, csgD, af Escherichia coli (E. coli). I E. coli, csgD er målrettet af de små ikke-kodende RNA, McaS, i samarbejde med et protein, regulering, at undertrykke protein-udtryk for CsgD^2,4,5. Teknikken bruges til at indføre mutationer i base-parring regionen mellem csgD og McaS og at bindingssted regulering af csgD. Fremstillet DNA er derefter klones til en vektor egnet til efterfølgende forsøg. Downstream anvendelser af teknikken omfatter både in vivo og in vitro-eksperimenter. For illustration, eksempel 1 er karakteriseret in vivo, ved hjælp af en western blot analysen og eksempel 2 er kendetegnet i vitro ved hjælp af en elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA). I begge tilfælde er det illustreret hvor site-directed mutagenese kan bruges i kombination med andre teknikker til at gøre biologisk konklusioner om et gen af interesse.

Protocol

1. vektor udvalg Vælg en vektor til at udføre downstream eksperimenter med. Enhver vektor er gældende for denne 2 – og 3-trins PCR metode. Baseret på valg af vektor, vælge passende restriktionsenzymer for kloning. 2. primer design for websted instrueret mutagenese Vælge mellem enten 2-trins eller 3-trins PCR strategi (2-trin er kun for mutationer < 200 bp fra begge ender af DNA af interesse). For 2-trins PCR, gå til trin 2.2 og 3-trins PCR gå til tri…

Representative Results

At undersøge RNA interaktioner med hensyn til post-transcriptional regulering af csgD, en dobbelt vektor setup blev valgt: en til at udtrykke csgD mRNA og en anden til at udtrykke de små ikke-kodende RNA, McaS. csgD er klonet i pBAD33, som er en arabinose inducerbar medium-kopi plasmid med chloramphenicol modstand og McaS blev klonet i mini R1 pNDM220, som er en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbar lav kopi plasmid med ampicillin-resistense…

Discussion

Site-directed mutagenese har en bred vifte af forskellige applikationer, og her, repræsentative resultater fra en in vivo og in vitro-eksperiment blev medtaget som eksempler på hvordan man laver biologiske konklusioner ved hjælp af teknikken. Site-directed mutagenese har længe været den gyldne standard for RNA interaktion undersøgelser. Styrken af teknikken, der ligger i kombinationen af at indføre relevante mutationer med downstream assays og eksperimenter (f.eks., vestlige skamplet eller EMSA) at drage konklusio…

Materials

Anti-GroEL antibody produced in rabbit	Merck	G6532	Primary antibody
Azure c200	Azure	NA	Gel imaging workstation
Custom DNA oligo	Merck	VC00021
DeNovix DS-11	DeNovix	NA	Spectrophotometer for nucleic acid measurements
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Scientific	R0611
Ethidium bromide solution 1 %	Carl Roth	2218.1
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi	Gerard Biotech	TO12	Dialysis tubes for electro elution
MEGAscript T7 Transcription Kit	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-Rad	1704406	Horizontal electrophoresis system
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse	Merck	F3165	Primary antibody
Mouse Immunoglobulins	Dako Cytomation	P0447	HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNA	Macherey Nagel	740971	RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Scientific	NP0323BOX	Bis-Tris gels for protein separation
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531S	DNA polymerase
PowerPac HC High-Current Power Supply	Bio-Rad	1645052
Rabbit Immunoglobulins	Dako Cytomation	P0448	HRP conjucated secondary antibody
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	Graph and data analysis software tool
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	PCR machine
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Ligase
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201S
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)	Thermo Scientific	B49