Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)
Summary
מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.
Abstract
הנשימה syncytial וירוס ספציפיים נטרול נוגדנים (RSV NAbs) הם סמן חשוב של הגנה כנגד RSV. מספר תבניות assay שונים הם נמצאים כעת בשימוש ברחבי העולם כך שאין צורך שיטה מדויקת, תפוקה גבוהה עבור מדידת RSV NAbs. נתאר כאן assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה אחר נושאים ‘ נבדק על קבוצת משנה של RSV A, ניתן להתאים גם עבור קבוצת משנה של RSV B סוגי דגימה שונים. שיטה זו היא מאוד לשחזור, עם וריאציות הבין-assay בנסיוב הפניה להיות פחות מ 10%. אנו מאמינים ש-assay הזה ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם במחיר נמוך יחסית. התפתחות assay משופרת, תפוקה גבוהה המודד RSV NAbs מייצג צעד משמעותי קדימה התקינה של שיטה זו ברחבי העולם, כמו גם להיות ביקורתיים להערכת המועמדים חיסון RSV הרומן בעתיד.
Introduction
הווירוס syncytial הנשימה (RSV) הוא הגורם המוביל של זיהומים בדרכי הנשימה התחתונה אוכלוסיית ילדים ברחבי העולם1. למרות משאו גבוהה, יש עדיין אין חיסון או טיפול זמין. משנת 2013, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הכריזה על פיתוח חיסון RSV כעדיפות המחקר העיקרי, עם2,פגישות ייעוץ העולמי השנתי3. המי שהסכים באמצעות RSV בנטרול מדידה נוגדנים (NAb) כדי לעקוב אחר חיסון immunogenicity, כפי זה מזוהה כמספר דה מרקר סרולוגית העיקריים של הגנה4. NAbs הוכחו להגן מפני זיהום חמור RSV במספר מחקרים, כמו גם ניסויים קליניים של palivizumab נוגדנים חד שבטיים אנטי-RSV, כיום אסטרטגיה מניעתי בלבד זמינים4.
קיימות מספר תבניות assay NAb בשימוש על ידי מעבדות ברחבי העולם, כולל מבחני מבוססת תא, מבוסס על מולקולרית, אשר עשו מאמצים סטנדרטיזציה מאתגר5,–6,–7,–8. עם זאת, וזמינותו ניטרול (PRN) פלאק קונבנציונלי-הפחתת המודד את מספר מופחת פלאק ויוצרים יחידות (PFU) על ידי הנוכחות של נוגדנים ספציפיים RSV נשאר עדיין תקן זהב9. כאן, אנחנו מדווחים פרוטוקול PRN משופרת מפושטת, תפוקה גבוהה יכול לשמש בשורות תאים רבים, זנים RSV ועם תפוקה מוגברת וזמינותו. פרוטוקול זה נבדקו באמצעות דגימות קליניות של הגדרות שונות, כמו גם על דגימות מן המודל החייתי ניסויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש שפותחה ואנו ממוטב פשוטה ויעילה RSV מיקרו-ניטרול assay זה ניתן להתאים בקלות במעבדות רוב. זה וזמינותו הוא היכולת למדוד את היכולת זיהום נגיפי, כמו גם מדידת עיכוב של זיהום נגיפי מאת NAb ברמה התאית באמצעות סריקת תמונה ממוחשב. השימוש של פלטפורמה מבוססת הדמיה של מערכות מבוססות נוגדן ספציפי גדל יריד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה לכל המשתתפים מעורבים. אנו להכיר תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני. PVL היא נמען מלגת פיתוח הקריירה NHMRC.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
