Un ensayo de Micro-neutralización de Virus sincitial respiratorio (VSR) mejorado y alto rendimiento
Summary
Este estudio describe un alto rendimiento, basado en la proyección de imagen de neutralización micro ensayo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes específicos para virus sincicial respiratorio (VSR). Este formato de ensayo ha sido probado en tipos diferentes de la muestra.
Abstract
Respiratorios sincicial virus específicos anticuerpos neutralizantes (NAbs de RSV) son un marcador importante de protección contra el VRS. Un número de formatos de ensayo diferentes está en uso en todo el mundo así que hay una necesidad de un método preciso y de alto rendimiento para medir RSV NAbs. Aquí describimos un análisis micro-neutralización basado en proyección de imagen que ha sido probado en el subgrupo de RSV A y también puede ser adaptado para RSV subgrupos B y tipos de muestras diferentes. Este método es altamente reproducible, con variaciones inter-ensayos para el antisuero de referencia siendo menos del 10%. Creemos que este análisis pueden establecerse fácilmente en muchos laboratorios en todo el mundo a un costo relativamente bajo. Desarrollo de un ensayo mejorado, de alto rendimiento que mide RSV NAbs representa un importante paso adelante para la estandarización de este método internacionalmente como críticos para la evaluación de nuevos candidatos vacunales de RSV en el futuro.
Introduction
Virus sincitial respiratorio (VSR) es la principal causa de infecciones del tracto respiratorio inferiores en la población pediátrica en todo el mundo1. A pesar de su alta carga, no existe todavía ninguna vacuna o tratamiento. Desde 2013, la Organización Mundial de la salud (OMS) ha declarado el desarrollo de una vacuna RSV como una prioridad de investigación, con reuniones consulta anual WHO2,,3. La OMS ha acordado con RSV neutralizando la medición de anticuerpos (NAb) para supervisar la inmunogenicidad de la vacuna, esto se reconoce como el marcador serológico más importante de protección4. Atrapó se han demostrado para proteger contra la infección de RSV grave en un número de estudios y ensayos clínicos del palivizumab anticuerpo monoclonal de anti-RSV, actualmente la estrategia profiláctico disponible4.
Existen múltiples formatos de ensayo NAb utilizados por laboratorios de todo el mundo, incluyendo análisis celular y molecular, que han hecho esfuerzos de estandarización difícil5,6,7,8. Sin embargo, el ensayo de neutralización (PRN) de reducción de placa convencional que mide el número de placa reducida formando unidades (PFU) por la presencia de un anticuerpo específico de RSV sigue siendo el estándar de oro9. Aquí, Divulgamos un protocolo PRN mejor, simplificado y de alto rendimiento que puede utilizarse en numerosas líneas celulares de diferentes cepas de RSV y con capacidad de análisis mayor. Este protocolo ha sido probada utilizando muestras clínicas de diferentes contextos, así como muestras de experimentos de modelo animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado y optimizado un ensayo micro-neutralización de RSV simple y eficiente que puede ser adaptado fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Este ensayo es capaz de medir la capacidad de infección viral así como la inhibición de la infección viral por NAb a nivel celular mediante análisis de imagen automatizado de medición. El uso de una plataforma basada en la proyección de imagen y sistemas basados en anticuerpos específicos ha aumentado la especificidad y la sensibilidad de detección punto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a todos los participantes. Reconocemos a programa de apoyo a infraestructura operativa del gobierno de Victorian. PVL es un recipiente de la beca de desarrollo de carrera de NHMRC.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
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- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
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