一种改进的高通量呼吸道合胞病毒 (rsv) 微中和检测方法
Summary
本研究描述了一种高吞吐量 、基于图像的微中和方法, 以确定呼吸合胞病毒 (rsv) 特异性中和抗体的滴度。这种检测格式已在不同的样品类型上进行了测试。
Abstract
呼吸道合胞病毒特异性中和抗体 (rsv nabs) 是预防 rsv 的重要标志。目前全球有许多不同的检测格式在使用, 因此需要一种精确、高吞吐量的方法来测量 rsv nabs。我们在这里描述了一种基于图像的微中和试验, 该方法已在 rsv a 亚群上进行了测试, 也可适用于 rsv b 亚群和不同的样本类型。该方法具有高度重现性, 参考抗血清的测定变化小于10%。我们相信, 这种检测方法可以很容易地在全球许多实验室以相对较低的成本建立。开发一种测量 rsv nabs 的改进的高通量检测方法, 是在国际上实现 rsv nabs 标准化的一个重要步骤, 也是今后评价新型 rsv 疫苗候选疫苗的关键。
Introduction
呼吸道合胞病毒 (rsv) 是全世界儿科人群下呼吸道感染的主要原因1。尽管负担很重, 但仍然没有疫苗或治疗方法。自2013年以来, 世界卫生组织 (世卫组织) 已宣布 rsv 疫苗的开发为主要研究优先事项, 世卫组织年度协商会议为 2、3.世卫组织已同意使用 rsv 中和抗体 (nab) 测量来监测疫苗的免疫原性, 因为这被认为是保护的主要血清学标志4。nab 已被证明可以防止严重的 rsv 感染在一些研究以及临床试验的抗 rsv 单克隆抗体 palizumab, 目前唯一的预防策略可用4。
世界各地的实验室使用多种 nab 检测格式, 包括基于细胞和分子的检测, 这使得标准化工作对 5、6、7、8具有挑战性。然而, 传统的减少斑块中和 (prn) 方法仍然是金标准 9, 该方法通过存在 rsv 特异性抗体来测量减少的斑块形成单元 (pfu)的数量。在这里, 我们报告了一个改进、简化和高通量的 prn 协议, 该协议可用于多种细胞系, 适用于不同的 rsv 菌株, 并提高了检测吞吐量。该方案已使用来自不同环境的临床样本以及动物模型实验的样本进行了测试。
Protocol
请注意:所有步骤都必须在 bsl2 引擎盖中执行, 除非另有说明。病毒滴定是需要在 prn 检测之前, 以确定在 prn 检测中使用的最佳 rsv 浓度。建议将病毒库存小批量, 将解冻一次, 并用于每次 nab 检测。还建议对一项研究中的所有样本进行的所有 nab 检测使用相同的病毒库存。在添加细胞板之前, 请确保培养基和磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 在37°c 加热。 1. rsv 病毒滴定 <p class="…
Representative Results
病毒库存的滴定从1:10 到 1:10 8 稀释, 以确定 prn 检测前的病毒库存浓度 (图5所示的代表性结果)。从图 5中, 在稀释量为 1:10 4 和 1:10 5时, 可以可靠地计算 pfu。计算了同一稀释情况下三井的 pfu 平均数量。由于 1:10 5 稀释时的平均斑点数为 14, 因此确定了这种病毒库存的病毒滴度如下: <p class="jove_c…
Discussion
我们开发和优化了一种简单高效的 rsv 微中和检测方法, 可在大多数实验室轻松应用。该方法能够测量病毒感染能力, 并通过计算机扫描在细胞层面测量 nab 对病毒感染的抑制。与传统的斑块检测方法 6、7相比, 基于图像的平台和特定抗体系统的使用提高了点检测的特异性和敏感性。这使得 rsv 菌株的特征具有较低的传染性, 并提供了准确的定量 rsv 浓度之?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢所有相关参与者。我们感谢维多利亚州政府的运营基础设施支持计划。pvl 是 nhmrc 职业发展奖学金获得者。
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
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- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
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Cite This Article
Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz, J., Anderson, J., Ong, D. S., Chappell, K., Mulholland, K., Licciardi, P. V. An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay. J. Vis. Exp. (143), e59025, doi:10.3791/59025 (2019).