Un flusso di lavoro semplice migrazione/invasione utilizzando un Imager di vivere-cella automatizzata
Summary
L’attuale protocollo descrive un metodo integrato, indagando la migrazione delle cellule tumorali e l’invasione su un’unica piattaforma in tempo reale, fornendo un’opzione facilmente riproducibile e tempo efficiente per studiare la morfologia e la mobilità delle cellule.
Abstract
Mobilità delle cellule di cancro è fondamentale per l’avvio della metastasi. Di conseguenza, indagine del movimento cellulare e capacità invasiva è di grande importanza. Saggi di migrazione forniscono conoscenza base del movimento cellulare a un livello 2D, considerando che le analisi di invasione sono più fisiologicamente rilevanti, che imita il dislodgment delle cellule tumorali in vivo dal sito originale e invadendo attraverso la matrice extracellulare. Il protocollo attuale prevede un unico flusso di lavoro per saggi di migrazione e invasione. Insieme con la fotocamera integrata di microscopica automatizzata per immagini HD in tempo reale e modulo built-in analisi, dà i ricercatori un tempo-efficiente, semplice e riproducibile opzione sperimentale. Questo protocollo comprende anche le sostituzioni per i materiali di consumo e metodi di analisi alternativa per gli utenti da scegliere.
Introduction
Invasione e migrazione cellulare sono importanti processi biologici che permettono le funzioni normali del corpo umano, come la chiusura della ferita, invasione di placenta in utero e della ghiandola mammaria morfogenesi1,2,3. Il corpo umano ha un controllo preciso e rigoroso di questi eventi biologici; Tuttavia, ci sono alcune eccezioni. I tumori maligni, ad esempio, sono in grado di sfuggire questa salvaguardia, esporre la proliferazione anormale e invadere nel tessuto limitrofo, che è chiamato metastasi. La metastasi è la causa principale della mortalità legata al cancro4.
Cancro al seno è il più comunemente diagnosticato cancro nelle donne ed è la seconda più alta causa di morte per cancro tra le donne in paesi sviluppati in tutto il mondo5. Cancro al seno è originario di condotti o lobuli costituiti da uno o più strati di cellule epiteliali. Nella mammella normale, cellule epiteliali aderiscano uno a altro e alla membrana basale attraverso proteine di membrana come E-caderina e integrine6. Tuttavia, cellule di carcinoma mammario invasivo hanno perso la loro polarità e adesione cellula-cellula e classicamente subiscono epiteliali transizione mesenchimale (EMT) e acquisiscono la capacità di muoversi. Dopo lo stravaso, queste cellule possono attraversare la matrice extracellulare (ECM) e immettere il vaso sanguigno o il sistema linfatico, seguita poi da intravasation e crescita metastatica7. La comprensione dei meccanismi con cui questo si verifica è di grande importanza, dal momento che è la causa più comune di mortalità legata al cancro ed è strettamente legata al cancro metastasi delle cellule migrazione/invasione. Per visualizzare il movimento delle cellule tumorali, saggi di migrazione e invasione sono modelli ideali per studiare il movimento delle cellule 2D e 3D, rispettivamente. Migrazione valuta direttamente il movimento delle cellule, mentre l’invasione comporta l’interazione con il microambiente e la capacità di degradare le barriere biologiche. I due processi non sono completamente indipendenti uno da altro, come la migrazione è un requisito dell’invasione.
Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare la migrazione e l’invasione. Come Recensito da Kramer et al., saggi di migrazione come la guarigione delle ferite, recinzione e saggi di micro-elemento portante generano una zona senza cellula per consentire alle cellule di muoversi in, valutare il cambiamento di zona; considerando che, in saggi di transwell e capillare sono basati sul numero di cellule che si muovono verso un attractant8. Per le analisi di invasione, un ambiente di ECM ha da istituire con ECM gel o collagene per esempio, e movimento 3D può essere valutata controllando i conteggi di zona, la distanza e la cella del invasione (ad es. analisi di transwell, analisi della platypus)8. Un altro tipo di analisi di invasione è di combinare le cellule invasive con cellule non-invasivo e valutare il comportamento delle cellule invasive (ad es. sferoide saggi). I metodi di cui sopra hanno il loro pro e contro e un modo di facile approccio, facile da ripetere e di combinare l’analisi di migrazione e invasione assay in un flusso di lavoro simile è preferenziale nel disegno sperimentale.
Questo protocollo descrive la misura della migrazione cellulare e invasione usando un imager di cellule vive. È un cellulare in tempo reale monitoraggio sistema installato in un’incubatrice di coltura cellulare standard. Prende immagini ad alta definizione secondo il set di intervalli e misurazioni di scansione applicando maschere appropriate per le celle o gli obiettivi fluorescenti. Il modulo di analisi di migrazione/invasione include l’utilizzo di uno strumento di gratta e Vinci 96-pin, che è adatto a fare ferite omogenee gratta e Vinci su un monostrato di cellule in una piastra a 96 pozzetti. Il meccanismo si basa sulla ferita in vitro guarigione dosaggi, monitoraggio movimento 2D cellulare su una plastica o rivestimento. Può essere valutato anche invasione o movimento 3D attraverso un ulteriore ECM entro il graffio della ferita. Un breve flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migrazione e invasione sono parametri importanti per valutare la mobilità delle cellule tumorali. Utilizzando lo strumento di gratta e Vinci di 96-pin, è possibile condurre la cicatrizzazione in saggi in 2D e 3D simultaneamente. Oltre a facilitare la scansione automatica, fornendo un ambiente di cultura cellulare stabile con il minimo disturbo, il dosaggio di gratta e Vinci condotto utilizzando il tool di gratta e Vinci di 96-pin fornisce costanti ferite gratta e Vinci, consentendo esperimenti che sono più robusti e r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i nostri finanziamenti a sostegno della Fondazione del gruppo di Bloomfield attraverso l’Istituto di ricerca medica Hunter (HMRI 13-02). X.Z è supportato da una borsa di studio di APA attraverso l’Università di Newcastle e HCRA biomarcatori Flagship PhD Scholarship.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
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- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
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- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
