Простая миграция/вторжения рабочий процесс, с помощью автоматизированных Imager клеток
Summary
Текущий протокол описывает комплексный метод исследования миграции клеток рака и вторжения на единой платформе в режиме реального времени, обеспечивая легко воспроизводимые и время эффективный вариант для изучения клеток мобильность и морфологии.
Abstract
Рак клеток мобильность имеет решающее значение для начала метастазов. Таким образом исследование клеточного движения и инвазивного потенциала имеет большое значение. Анализов миграции обеспечивают основные понимание клеточного движения на 2D уровне, тогда как вторжения анализов более физиологически важны, подражая в естественных условиях раковых клеток выскальзывание из оригинального сайта и вторжение через внеклеточного матрикса. Текущий протокол обеспечивает один рабочий процесс для миграции и вторжения анализов. Вместе с комплексной автоматизированной микроскопических камеры для реального времени изображения HD и модуль встроенного анализа это дает исследователи время эффективный, простой и воспроизводимые экспериментальный вариант. Этот протокол также включает замены расходных материалов и методов альтернативного анализа для пользователей, чтобы выбрать из.
Introduction
Миграции клеток и вторжения являются важные биологические процессы, которые позволяют нормальных функций в теле человека, таких, как закрытие раны, вторжение плаценты в матки и молочной железы морфогенеза1,2,3. Человеческое тело имеет точного и строгого контроля этих биологических событий; Однако есть некоторые исключения. Злокачественные опухоли, например, возможность избежать этой гарантии, демонстрируют ненормальное распространения и вторгнуться в соседние ткани, которая называется метастазированием. Метастазирование является главной причиной смертности, связанной с раком4.
Рак молочной железы является наиболее часто диагноз рака у женщин и является вторым по величине причиной связанных с раком смерти среди женщин в развитых странах во всем мире5. Рак молочной железы происходит от протоки или долек, которые состоят из одного или нескольких слоев эпителиальных клеток. В нормальной груди эпителиальные клетки придерживаться друг с другом и базальной мембраны через мембранных белков, таких как E-Кадгерины и интегринов6. Однако инвазивным молочной железы клетки рака потеряли их полярность и клеток клеточной адгезии и классически пройти переходного эпителия мезенхимы (EMT) и получить возможность перемещения. После кровоподтек эти клетки пересекают внеклеточного матрикса (ECM) и введите кровеносного сосуда или лимфатической системы, затем следуют intravasation и метастатические роста7. Понимание механизмов, посредством которых это происходит, имеет большое значение, поскольку метастаз является наиболее распространенной причиной смертности, связанных с раком и тесно связана с раком клетки миграции/вторжения. Чтобы визуализировать движение раковых клеток, миграции и вторжения анализов являются идеальной модели для изучения 2D и 3D клеточного движения, соответственно. Миграции непосредственно оценивает движение клеток, тогда как вторжения включает в себя взаимодействие с микроокружения и способность к разложению биологические барьеры. Эти два процесса не являются полностью независимыми друг от друга, как миграция является требованием вторжения.
Несколько методов были разработаны для изучения миграции и вторжения. Как рассмотрено, Крамер et al., анализов миграции как ранозаживляющее, забор и микро перевозчик анализов генерировать клетки свободно OBLASTь разрешить клетки переехать в, оценка изменения площади; в то время как transwell и капиллярной анализы основаны на количество клеток, которые двигаться в сторону аттрактанта8. Для вторжения анализов, ECM среды должен быть установлен с ECM гель или коллагена например, и 3D движения могут быть оценены путем наблюдения за вторжения области, расстояние и клеток обвинения (например, transwell проба, Утконос пробирного)8. Другой тип вторжения пробирного является объединить инвазивных клетки с неинвазивные клеток и оценить поведение инвазивных клеток (например, assays сфероида). Эти методы имеют свои плюсы и минусы и путь, это простой подход, легко повторить и объединить assay переноса и пробирного вторжения в рабочем процессе подобных преференций в экспериментальный дизайн.
Этот протокол описывает измерение миграции клеток и вторжения, с помощью томографа живой клетки. Это реальном времени ячейки, мониторинга системы, установленной в инкубатор культуры стандартной ячейки. Он принимает изображения высокой четкости согласно сканирование интервалы и измерения, применяя соответствующие маски в клетки или флуоресцентные целей. Модуль миграции/вторжения пробирного включает в себя использование 96-контактный скретч инструмент, который подходит для создания однородной скретч раны на монослое клеток в 96-луночных пластине. Этот механизм основан на в пробирке рану исцеление анализов, мониторинг 2D клеточного движения на пластиковом или с покрытием поверхности. Можно также оценить вторжения или 3D движение через дополнительные ECM в пределах нуля раны. Краткий рабочий процесс проиллюстрирован на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Миграция и вторжения являются важными параметрами для оценки подвижности раковых клеток. Используя инструмент скретч 96-pin, это возможно для проведения анализов в 2D и 3D ранозаживляющее одновременно. Помимо содействия автоматическое сканирование, обеспечение стабильной клетки культур?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить нашу финансовую поддержку Фонда группы Блумфилд через охотник медицинский научно-исследовательский институт (КЖДИ 13-02). X.Z поддерживается АПА стипендии через университета Ньюкасла и HCRA биомаркеров флагман PhD стипендии.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics Proteomics. 9, 311-320 (2012).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
