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Genetics

Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Abstract

Les gènes de virulence bactérienne sont souvent réglementés au niveau transcriptionnel par de multiples facteurs qui répondent aux différents signaux environnementaux. Certains facteurs agissent directement sur les gènes de virulence ; d’autres contrôlent la pathogénie en ajustant l’expression des régulateurs en aval ou l’accumulation de signaux qui affecte l’activité de l’organisme de réglementation. Alors que le règlement a été largement étudiée au cours de la croissance in vitro , on connaît relativement comment l’expression des gènes est ajustée au cours de l’infection. Ces informations sont importantes lorsque le produit d’un gène particulier est un candidat pour une intervention thérapeutique. Transcriptionnels approches comme la RT-PCR quantitative, en temps réel et RNA-Seq sont de puissants moyens pour étudier l’expression des gènes au niveau mondial, mais souffrent de nombreux défis techniques, y compris de faible abondance d’ARN bactérien par rapport à l’hôte ARN et échantillon dégradation par les RNases. Évaluation de règlement à l’aide de reporters fluorescents est relativement facile et peut être multiplexé avec des protéines fluorescentes ayant des propriétés spectrales uniques. La méthode permet une analyse unicellulaires, spatio-temporelle de l’expression génique dans les tissus qui présentent des dégradés architecture et physiochimiques tridimensionnelles complexes qui influent sur les réseaux de régulation bactériens. Ces informations sont perdues lorsque les données sont en moyenne sur la population en vrac. Ici, on décrit une méthode pour la quantification de l’expression de gène dans les bactéries pathogènes in situ. La méthode repose sur le traitement de tissus simples et l’observation directe de la fluorescence des protéines de journaliste. Nous démontrent l’utilité de ce système en examinant l’expression de Staphylococcus aureus Thermonucléase (nuc), dont le produit génique est requis pour évasion immunitaire et virulence complet ex vivo et in vivo. Nous montrons que nuc-gfp est fortement exprimé dans les abcès rénales et révéler l’expression des gènes hétérogène due en partie à apparent règlement spatiale de l’activité de promoteur nuc en abcès pleinement engagée avec la réponse immunitaire. La méthode peut être appliquée à toute bactérie avec un système génétique balayages et de n’importe quel modèle d’infection, fournir des informations précieuses pour les études précliniques et développement de médicaments.

Introduction

Bactéries répondent à l’évolution des conditions physiologiques et les modifications de l’état nutritionnel de leur environnement de façon différentielle exprimant des gènes nécessaires à l’adaptation et la survie. Par exemple, des agents pathogènes opportunistes colonisent les corps des surfaces à relativement faible densité et sont souvent inoffensifs. Cependant, une fois que la bactérie a pénétré les barrières physiques et chimiques, il doit composer avec Counter-défenses des cellules immunitaires de l’hôte et de la disponibilité restreinte des nutriments1. À titre d’exemple, Staphylococcus aureus colonise environ le tiers de la population de façon asymptomatique, mais est également la cause de dévastateur de la peau et des tissus mous, ostéomyélite, endocardite et bactériémie2. Le succès S. aureus comme un pathogène est souvent attribué à sa flexibilité métabolique, mais aussi un arsenal de facteurs de virulence de surface associées et sécrétées qui permettent à la bactérie d’échapper à la circulation sanguine et se répliquer dans les tissus périphériques 3,4,5. Parce que l’hôte mort due à une maladie staphylococcique est une impasse évolutive et la transmission de limites aux nouveaux hôtes6, l’engagement à la production de facteur de virulence doit être soigneusement contrôlée.

Un réseau complexe de réglementation des protéines et répond d’ARN non codants à une variété de stimuli environnementaux, y compris de cellules densité, phase de croissance, facteurs associés à neutrophile et disponibilité des nutriments, pour s’assurer que les gènes de virulence sont exprimées à la heure exacte et l’emplacement au sein de l’hôte tissus7,8,9,10,11,12,13. Par exemple, le système à deux composants SaeR/S (TCS) régule l’expression de plusieurs facteurs de virulence par la kinase de capteur (SaeS) et la réponse régulateur (SaeR)14. SaeS est autophosphorylated sur un résidu histidine conservée en réponse à l’hôte des signaux (par exemple, human neutrophiles peptides [HNPs], calprotectine)8,15,16. Le groupe phosphoryle est ensuite transféré dans un résidu aspartate sur SaeR, activant ce dernier comme une protéine de liaison à l’ADN (SaeR ~ P)17. Le SDC SaeR/S réglemente plus de 20 gènes qui contribuent à la pathogénèse, y compris les protéines de liaison de la fibronectine (FnBPs), leukocidins et staphylocoques à coagulase14,18,19,20. Cibles peuvent être classées en haute affinité et de faible affinité gènes cibles, qui sont probables induit que le niveau de SaeR ~ P augmente lorsqu’ils sont exposés à ses repères21. L’activité de SaeR/S est contrôlée par les autres organismes de réglementation de l’expression des gènes tels que le système de détection de quorum Agr, répresseur de protéine de toxines (Rot) et l’autre facteur sigma B (SigB)22,23,24.

NUC est un gène de virulence de Sae-dépendante chez Staphylococcus aureus et encode la Thermonucléase (Nuc), qui est essentiel pour échapper à neutrophilic emi tpa (filets) et pour la diffusion au cours de la cours de l’infection de25,26. L’expression du nuc est également fortement indirectement réprimée par CodY en présence d’acides aminés à chaîne ramifiée et GTP27et directement réprimée par la protéine staphylococcique accessoires régulateur SarA28,29 , dont l’activité est influencée par l’oxygène (état d’oxydoréduction) et pH30. Étant donné que les mutants sae et nuc sont atténués dans les modèles de souris de l’infection, il y a intérêt à développer des interventions chimiques qui inhibent leur correspondant activités26,31. Malgré cela, il n’y a aucune information au sujet de leur règlement au cours de l’infection.

Fluorescents reporters ont été utilisés pour surveiller et quantifier l’expression des gènes au niveau de la cellule unique. Ici, nous présentons une méthode de quantification de la S. aureus l’expression des gènes au cours de l’infection qui, lorsqu’il est associé avec analyse du transcriptome in vitro et puissantes techniques d’imagerie comme l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la spectroscopie par résonance magnétique (SRM), peuvent révéler comment bactérienne la physiologie est réglementée in vivo et l’abondance relative des éléments nutritifs dans certains créneaux. La méthode peut être appliquée à toute bactérie pathogène avec un système génétique tractable.

Vue d’ensemble du vecteur génomique intégrative.

La génomique intégrative vecteur pRB4 contient 500 paires de bases chaque des régions en amont et en aval de la pseudogène USA300 de Staphylococcus aureus SAUSA300_0087 pour faciliter la recombinaison homologue. pRB4 est dérivé de l’épine dorsale le vecteur thermosensibles pMAD contenant la cassette de résistance à l’érythromycine (ermC) et bêta-galactosidase thermostable gène bgaB pour le dépistage de bleu/blanc de recombinants32. La journaliste ingénierie construction contient également un marqueur de résistance de chloramphénicol (cat) pour la sélection après l’intégration du génome et élimination de plasmide, ainsi que des sites EcoRI et SmaI à fusionner la région régulatrice d’intérêt au vert superfolder protéine fluorescente (sGFP) (Figure 1). On sait que le choix du site de liaison du ribosome (RBS) influe sur l’activité du reporter et exige souvent empiriques optimisation33. Ainsi, un RBS n’est pas fourni. Ici, le site de fixation du ribosome native est utilisé pour fournir un modèle plus naturel de l’expression des gènes, mais les autres sites peuvent être utilisés.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Georgetown.

1. génération de la souche de journaliste Fluorescent

  1. Digérer le vecteur d’intégration pRB4 génome séquentiellement avec les enzymes de restriction EcoRI et SmaI. Suivant le protocole du fabricant, mis en place une digestion au jour le jour avec la SmaI à l’aide de 1 µg de pRB4 à 25 ° C et ensuite procéder à la seconde digestion pendant 1h à 37 ° C en ajoutant EcoRI au mélange réactionnel. Inactiver les enzymes en incubation à 65 ° C pendant 20 min.
  2. PCR amplifier la région régulatrice de l’intérêt de l’ADN génomique (dans ce cas, un paire de base ~ 350 fragment d’ADN contenant la région promotrice de Thermonucléase [nuc]), intégrant un 5' site de restriction EcoRI et un site de restriction de SmaI 3'. La séquence de reconnaissance SmaI doit être dans le cadre avec le codon de départ. Dans cette étude, la PCR a été réalisée en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité selon les recommandations du fabricant avec apprêt avant oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') et inverse (apprêt) oRB016 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). La température de recuit a 53 ° C. Purifier le fragment résultant à l’aide d’un kit de nettoyage PCR suivant les instructions du fabricant.
  3. Digérer le produit résultant de la PCR avec EcoRI et SmaI interprété à l’étape 1.1 et ligaturer le fragment d’ADN digéré pour les mêmes sites de pRB4 à l’aide de T4 DNA ligase tel que recommandé par le fabricant pour générer la construction intégrative. Introduire le mélange de ligation dans e. coli et confirmer la séquence de la construction.
  4. Electroporate la construction en souche de S. aureus RN4220 comme décrit précédemment34. En bref, utiliser 1 µg de plasmide avec 70 µL de cellules capables d’electro (Ω 100, 25 µF et 2,3 kV) dans un bouillon de B2 (hydrolysat de caséine de 1 % [p/v], extrait de levure 2,5 % [p/v], 2,5 % [p/v] NaCl, 0,1 % [p/v] K2PO4, 0,5 % [p/v] Glucose). Sélectionner pour la résistance à l’érythromycine (Emr) à la température permissive (30 ° C) sur la gélose trypticase soja (TSA) additionnée de l’érythromycine (5 µg mL-1) et 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal ; 80 µg mL-1). Les transformants qui en résultent sont bleus en raison de l’activité β-galactosidase plasmidique codée.
    Remarque : Transfert d’ADN dans des isolats cliniques est extrêmement difficile en raison d’une forte restriction-modification barrière35. Ainsi, RN4220 de S. aureus a été utilisé comme bénéficiaire intermédiaire de la construction de fusion parce qu’il y a restriction déficiente et hautement transformable.
  5. Transfert plasmidique à souche USA300 de Staphylococcus aureus d’intérêt à l’aide d’électroporation ou induite par le phage transduction36 à la température permissive. En bref, propager bactériophage de11 Φ des particules sur la souche du donneur à l’aide de plaques TSA contenant 5 mM CaCl2 à 30 ° C la nuit et puis stérilisent par filtration à travers un filtre seringue en acétate de cellulose 0,45 µM. Lysats permet de transduce souche de Staphylococcus aureus LAC Emr.
    Remarque : LAC est un isolat clinique largement utilisé qui a été précédemment effectué Em sensibles par serial passage dans le milieu du BST pour guérir la souche de la pUSA03 native plasmide qui confère Emr 37,38.
  6. Intégrer la construction par deux, événements de recombinaison homologue successives dans le chromosome comme décrit plus haut32. Les recombinants sont résistant au chloramphénicol (Cmr) sur des plaques TSA contenant 5 μg mL-1 de chloramphénicol, sensibles à l’érythromycine (Erms) et pas plu bleu.
    Remarque : Lorsque cela est possible, réintroduire la fusion marquée en USA300 via induite par le phage transduction pour éviter l’accumulation de mutations associées à in vitro de la souche passage quarts de39 et de la température.

2. animal de l’Infection : Préparation de l’Inoculum, Infection systémique et le traitement de tissus

  1. Préparation de l’inoculum bactérien
    1. Ensemencer des souches de Staphylococcus aureus d’intérêt pour l’isolement sur géloses au sang provenant d’un stock de glycérol congelés. Incuber à 37 ° C pendant 16 à 24 h confirmer des phénotypes hémolytiques basés sur leur capacité à lyser les globules rouges (hématies) et forme claire des zones transparentes.
    2. Initier les cultures une nuit ou pluss en inoculant des colonies individuelles de chaque souche jusqu'à 4 mL de bouillon trypticase soja (TSB) dans des tubes de verre stériles. Faire pivoter les tubes à 37 ° C pendant 16 à 24 h dans un rouleau tube, fixé à environ un angle de 70° et 70 tours par minute [tr/min].
    3. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) des cultures de l’étape 2.1.2. Utilisez milieu stérile comme une référence optique (vide). Diluer ces cellules à une OD600 de 0,05 à 25 mL de stérile Trypticase soja bouillon (BST) dans séparé, 125 mL DeLong flacons (flacon de 5:1 ratio volume) et incuber les cultures dans un bain d’eau (pour le transfert de la chaleur appropriée aux cultures), secouant à 280 tr/min et réglé à 37 ° C.
      Remarque : La croissance de l’inoculum peut être effectuée de différentes façons ; une méthode pour cultiver des cellules de phase exponentielle est présentée. Malgré tout, il est important de toujours utiliser la même méthode pour la préparation des cellules pour l’inoculation.
    4. Une OD600 de ~ 1, re-diluer les cellules dans un milieu frais à un départ de l’OD600 de 0,05 à s’assurer que les cellules de réaliser la phase exponentielle et que les facteurs qui s’accumulent durant l’incubation durant la nuit ont été réduits à des niveaux de phase exponentielle.
    5. Récolter les cellules au cours de la phase exponentielle (OD600 ~0.6–0.8) par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
    6. Laver les granules deux fois dans un volume équivalent de stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4).
    7. Suspendre les cellules dans du PBS 1 x (pH 7,4) à une concentration de 1 x 108 colonies formant des unités (UFC) mL-1 ou selon qu’il conviendra pour le souhaité expérimenter.
      Remarque : il est important de déterminer la relation entre OD600 et CFU mL-1 pour chaque souche d’intérêt parce que les altérations liées à la souche de la forme et la taille des cellules peuvent affecter les propriétés de diffusion de la lumière et au bout du compte, la dose d’infection.
  2. Préparation des animaux et des infections bactériennes
    1. Acclimater souris pendant 7 jours sur régime purifié AIN-93. La diète est formulée pour assurer une nutrition adéquate tout en réduisant le tissu auto-fluorescence associé à la consommation d’ingrédients à base de plantes utilisés en souris standard chow40.
      Remarque : Les souris C57/BL6 femelles (6-8 semaines) sont utilisés ici, mais la souche de souris et le sexe dépendra de l’étude.
    2. Avant l’infection, dilater les veines de queue de souris à l’eau tiède.
    3. Infecter les animaux par injection 100 µL de l’inoculum bactérien par queue-veines de produire une infection systémique. Enregistrer une partie aliquote de l’inoculum initial si vous effectuez la cytométrie en flux (voir la Section 4).
    4. Suivi des animaux par jour et d’évaluer leur état de santé à l’aide d’un système de contrôle révisés et approuvés par l’animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.
    5. Permettre à l’infection au progrès, pour la durée désirée. Ici, les essais sont terminés 3 jours après l’infection.
      Remarque : Dans ces conditions, les abcès se composent d’une communauté d’abcès staphylococcique de bactéries, délimitée par des dépôts de fibrine et entouré par des couches concentriques de cellules immunitaires5,41.
  3. Récolte les organes et le traitement de tissus
    1. Euthanasier les animaux par l’inhalation de CO2 et de la dislocation cervicale comme méthode secondaire et effectuer l’autopsie.
    2. Récolter les reins (à droite) et autres organes vitaux (poumons coeur, foie, rate) et transférer dans 15 mL tubes en polypropylène contenant du formol 10 % [v/v] mis en mémoire tamponné. Aller de l’avant avec ces organes à l’étape 2.3.4 ci-dessous.
    3. Transférer le rein gauche dans un tube résistant aux chocs de stériles de 2 mL, contenant environ 500 µL de perles de silice de 2 mm et 1 mL stérile 1 x PBS (pH 7,4). Passer avec cet organe au point 4.2.
    4. Permettre aux organes de l’étape 2.3.2 de fixer dans l’obscurité à température ambiante avec agitant doucement ou de rotation au moins 24 heures, mais pas plus de 48 heures.
    5. Incorporer les organes dans le tissu clair moyen de congélation et stocker les tissus à-80 ° C.
    6. En utilisant un cryostat, tissu de section en tranches de 10 µm d’épaisseur.
    7. Les sections sur une lame de verre préalablement nettoyé, chargé pendant 20 min à sec dans l’obscurité, s’appliquent à milieu de montage difficile avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) teinté et lamelle couvre-objet. Guérir des diapositives montées à température ambiante pendant la nuit et transfert à 4 ° C pour le stockage à long terme.

3. traitement d’Image et microscopie confocale à balayage au laser

  1. Examiner des diapositives montées pour localiser les lésions à l’aide de lasers appropriés pour le journaliste fluorescente utilisée. Dans ce cas, la verte (GFP), rouge (tdTomato) et fluorescence (DAPI) bleue de signaux sont utilisés.
  2. Acquérir l’image en utilisant l’objectif pour la visualisation des cellules individuelles (par exemple, 20 x ou 40 x objectifs on utilise généralement).
  3. Mesurer les intensités de fluorescence dans les images confocales.
    1. Ouvrez l’image confocale en Image J et régler la luminosité/contraste afin de visualiser correctement le signal de fluorescence de la lésion.
    2. Définir la zone d’intérêt et en utilisant l’option de seuillage , définir les limites inférieures et supérieures de fluorescence que nécessaire.
    3. Définir le centre de gravité en sélectionnant zone → valeur de gris moyen → centroïde → limiter au seuil de sous l’onglet analyse dans Image J.
    4. Extraire la valeur d’intensité de centroïde fluorescence ou la mesure de l’intensité de fluorescence moyenne dans une lésion donnée par unité de surface (fluorescence de moyenne intensité, IFM) pour GFP et tdTomato. Ici, les zones d’un µm2 ont été utilisés.
      Remarque : Une deuxième analyse aveugle minimise la partialité lorsque l’identité de l’échantillon est connue.
    5. Tracer les données et effectuer des analyses statistiques appropriées pour chaque comparaison.

4. analyse en cytométrie en flux

  1. (Facultatif) Déterminer l’activité de fusion de l’inoculum sur le jour de l’infection (à partir de la section 2.2.3)
    1. À 899 µL de 1 x PBS stérile (pH 7,4) ajouter 100 µL de chaque inoculum et 1 µL de membrane nucléique perméants stain (voir Table des matières). Comme témoin, n’oubliez pas d’inclure un échantillon dépourvu d’acide nucléique tache.
    2. Effectuer l’écoulement cytometry sur tous les échantillons.
      Remarque : Pour la toute première expérience, il est utile d’inclure un contrôle seul vecteur pour la fusion d’intérêt pour déterminer la tension d’utilisation. Une séparation claire entre les échantillons positifs et négatifs est essentielle pour l’analyse des données, indiquant le journaliste est bien au-dessus de signal de fond.
    3. Pour identifier la population bactérienne, tracer les événements à l’aide d’acide nucléique tache (axe y) et avant la dispersion (axe x).
    4. Dessiner une grille d’inclusion autour des événements qui sont deux acides nucléiques tache positive et la taille correcte de la bactérie basée sur le forward scatter (entre 0,5 à 2,0 µm pour S. aureus).
      Remarque : Faire preuve de rigueur lorsqu’on veut identifier cette population car il est important d’inclure des événements qui sont clairement dans ces paramètres. Veillez à ce que cette porte exclut tous les événements pour les contrôles négatifs dans d’autres conditions. Dans cette étude, environ 70 % la population cellulaire satisfait ces exigences dans l’analyse.
  2. Analyse des échantillons de tissus après le sacrifice :
    1. Euthanasier les animaux, récolter les reins gauche (voir l’étape 2.3), et transfert en perle-battant tubes contenant 1 mL de 1 x PBS stérile (pH 7,4) et 250 µL de perles borosilicaté de 2 mm.
    2. Perturber les tissus pour libérer les cellules bactériennes. Pour les reins, utilisez un homogénéisateur pour perturber les cellules. Ici, trois 30 s salves à 6800 tr/min avec 1 min périodes sur glace mouillée entre les cycles de refroidissement ont été utilisées pour réduire au minimum le chauffage des échantillons.
    3. Pellet, le plus gros débris tissulaires par centrifugation à 250 x g pendant 3 min dans une micro-centrifugeuse table refroidi à 4 ° C.
      Remarque : En général, il y a un culot au fond du tube et une couche de débris flottants sur le dessus. La couche du milieu aqueuse contient les cellules bactériennes.
    4. Transférer 10 µL de la phase aqueuse dans un tube de microcentrifuge propre 1,5 mL contenant 1 µL de tache d’acide nucléique dans 989 µL de PBS (volume total 1 mL).
    5. Effectuer la cytométrie de flux en utilisant les mêmes paramètres d’acquisition de données et de processus de blocage en ce qui concerne l’inoculum initial.
      Remarque : Des numérations bactériennes sera très faibles car l’échantillon contient principalement des débris tissulaires. L’option « Live gate » peut également servir si les cellules sont tache acide nucléique positive et découpage en taille lorsque les données sont chargées dans l’application. Cela aidera aussi à analyser plusieurs des événements cible et réduire la taille du fichier. Événements presque 1 million par exemple sont comptés, mais plusieurs chefs d’accusation des événements peuvent être nécessaires en fonction de la gravité de l’infection et la taille du tissu analysé.
    6. Analyse des données : Déterminer ce que signifie intensité de fluorescence (MFI) pour chaque fluorophore dans un échantillon donné, en utilisant les portes d’inclusion déterminés au point 4.1.4. Normaliser les échantillons dans le logiciel d’analyse de flux d’événement chefs d’accusation. 10 000 chefs d’accusation sont généralement suffisants dans l’analyse.
      Remarque : Il n’est pas rare de trouver des échantillons qui contiennent moins de ce nombre d’événements puisqu’il s’agit dépend de la sévérité de la formation et l’infection abcès. En utilisant cette approche, 500-40 000 événements sont trouvent dans les tissus infectés.

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Representative Results

Nous avons développé un plasmide dérivé pMAD32 qui peut fournir n’importe quel journaliste construct de fusion dans le chromosome par recombinaison homologue double filtre (Figure 1). Cette construction permet d’analyse quantitative de toute région régulatrice qui prend en charge la production de la protéine GFP et signal fluorescent au-dessus de fond. Le plasmide confère la résistance à l’ampicilline (Apr) pour l’entretien et la propagation chez e. coli et confère la résistance à l’érythromycine (Emr) en S. aureus. La construction confère également la résistance de chloramphénicol (Cmr), qui permet de faciliter le transfert de la fusion de journaliste intégré entre différentes souches mutantes pour analyse génétique sophistiquée dans S. aureus.

Comme preuve de principe, nous avons fusionné la nuc région régulatrice à gfp. nuc a été choisie parce que son produit de gène est nécessaire pour la virulence complet et est nécessaire pour limiter les macrophages de s. aureus -induit des abcès42, 43. La construction a été intégrée dans le chromosome comme décrit aux points 1.4-1.6 du protocole. La fusion intégrée a été ensuite transférée à AH3926 qui contient une fusion de tdTomato - PsarAP1. La sarA promoteur P1 a été montré précédemment être constitutivement actif44 et étiquettes ainsi, toutes les cellules.

Tout d’abord, nous avons vérifié que les fusions de journaliste étaient actifs pendant in vitro shake croissance de fiole en bouillon de Trypticase soja (TSB ; un milieu riche et complex) et que les niveaux de fluorescence étaient au-dessus de l’arrière-plan d’auto-fluorescence cellulaire (Figure 2). Pour déterminer comment les journalistes fluorescents se comportent in vivo, un modèle mis à jour l’abcès rénal a été utilisé5. Groupes de souris C57BL/6 femelles ont été contestées par voie intraveineuse avec 1 x 107 UFC chaque cellules de S. aureus LAC dépourvues de fusions de journaliste ou cellules LAC transportant des fusions de la nuc-sGFP et sarAp1-tdTomato . Animaux ont été sacrifiés trois jours après l’infection. Puis, les organes récoltés ont été fixés dans du formol 10 % [v/v] mis en mémoire tampon, cryo-sectionné et imagés par microscopie confocale après coloration DAPI comme décrit aux étapes 2 et 3 (Figure 3A, B). Les images ont été analysées à l’aide d’Image J et fluorescence par unité de surface dans les lésions rénales a été mesurée. Comme illustré à la Figure 3C, fluorescence fusion nuc-gfp a été en moyenne près de 9 plus élevée dans les cellules porteuses de la fusion que dans les cellules n’exploite ne pas la fusion de journaliste ; le signal de ce dernier constitue la limite de détection (auto-fluorescence) (comparez nuc-sGFP à BAC). De même, la fluorescence de fusion PsarAP1- tdtomato a ~ 6 fois plus élevé que l’aucun contrôle de journaliste (Figure 3E, comparer sarAP1- tdT vs LAC). Utilisant l’écoulement cytometry, le patron des activités de journaliste a été confirmé à l’aide d’homogénats de rein et cytométrie en flux tel que décrit à l’étape 4, si le pli des différences dans la fluorescence ont été inférieure (Figure 3D, F).

Fait intéressant, les données de fluorescence de lésions formées par les cellules porteuses des fusions de journaliste fluorescents semblent montrent une variabilité plue que qui ne possèdent pas les journalistes. On se demandait si la variation dans les mesures de fluorescence observée était due à une expression hétérogène des reporters (c'est-à-dire d’origine biologique). En effet, à distance de ~ 100 µm, il a été constaté que certaines lésions exprimé une ou les deux reporters (Figure 4). Ce qui est important, examinant l’activité de journaliste avec une résolution de cellule unique dans les collectivités de l’abcès staphylococcique (ZSC) révélé spatiale régulation de l’expression de nuc en abcès circonscrit avec forte DAPI souillant, probablement liés à la formation et le rejet de neutrophile extracellulaire des pièges (Figure 5A-C)45. Par exemple, nous avons mesuré la fluorescence de fusion nuc-sGFP significativement plus élevé dans l’âme intérieure du SAC comparée à celle sur la périphérie (Figure 5B, E). Dans le même abcès, pour fluorescence fusion sarAp1-tdTomato , le modèle semble être inversé (Figure 5D). Toutefois, le modèle n’était pas statistiquement significatif, utilisant le même nombre d’animaux (Figure 5F).

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la génomique intégrative journaliste plasmide pRB4. PRB4 de plasmide est un dérivé du pMAD avec une origine sensibles de température de réplication chez S. aureus (Ori pE194ts). Il y a trois marqueurs de résistance aux médicaments : (i) bla, conférant la résistance à l’ampicilline chez Escherichia coli; (ii) ermC, conférant la résistance à l’érythromycine chez S. aureus; et (iii) chat, conférant une résistance au chloramphénicol chez S. aureus. La construction de la journaliste est flanquée de ~ 500 bp chaque des séquences en amont et en aval de la pseudogène SAUSA300_0087 (génome de référence : FPR3757) pour double filtre homologue recombinaison et génome l’intégration. gène de protéine fluorescente sGFP, vert ; CS, site de clonage ; TT, terminateur transcriptionnel bidirectionnelles fortes. La figure n’est pas à l’échelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : J’ai intégrée NUC-sGFP et sarAp1-tdTomato journalistes sont exprimés au cours de la croissance in vitro . S. aureus LAC des cellules (sauvage [WT]), avec ou sans le (A) nuc -sGFP ou (B) sarAp1-tdTomato reporters) ont été cultivés à phase exponentielle au BST et re-dilués dans le même milieu. Densité optique (Do) et la fluorescence ont été mesurées les valeurs de densité optique indiquée. Valeurs d’intensité de fluorescence de fond-soustrait (excitation/émission : sGFP, 485/535 nm ; tdTomato [tdT], 535/590 nm) ont été divisés par les valeurs de densité optique pour générer des unités de Fluorescence Relative. Les données constituent le moyen +/-SEM de deux expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Reporters fluorescents sont visibles dans le tissu rénal. Groupes de 13 souris C57BL/6 ont été contestées par voie intraveineuse avec LAC cellules ou cellules LAC transporter nuc-sGFP et sarAp1-tdTomato (tdT)et l’infection a été autorisée à aller de l’avant pendant trois jours. Souris ont été euthanasiés et organes ont été traitées comme décrit aux étapes 2 et 3 du protocole. Coupe de rein représentant montrant des lésions multiples et la fluorescence associée pour (A) nuc-sGFP et (B) sarAp1-tdTomato. Barreaux de l’échelle = 250 µm (objectif 10 x). L’unité Relative de la Fluorescence par unité de surface (RFU [μm2]-1) associée à des lésions rénales ont été mesurées à l’aide de l’analyse d’images, tel que décrit à l’étape 3.3 et ont été tracées pour (C) nuc-sGFP et (E) sarAp1-tdTomato; chaque point représente une lésion et les barres indiquent la médiane ; 3-5 lésions analysées par souris. Écoulement cytometry analyse de nuc-sGFP de la (D) et (F) sarAp1-tdTomato fluorescence de fusion dans les populations bactériennes isolées de rein infecté homogénats trois jours après l’infection. L’intensité de Fluorescence signifie (IFM) est indiqué par la barre pleine, et chaque point est un rein. LAC, reporterless souche sauvage. Statistiques : Test de Mann-Whitney ; p < 0,05. Les données sont représentatives des deux expériences indépendantes. Les longueurs d’onde d’excitation pour les canaux de fluorescence sont les suivantes : DAPI, 405 nm ; GFP, 488 nm ; tdTomato, 561 nm. Fluorescence émise sont collectées sur une plage de longueurs d’onde : DAPI, 419-481 nm ; sGFP, 505-551 nm ; tdTomato, 575-630 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Abcès pièce expression variable des reporters dans les tissus rénaux. Groupes de 13 souris C57BL/6 ont été contestées avec 1 x 107 UFC de S. aureus cellules via la veine caudale. Animaux ont été euthanasiés trois jours après l’infection. Reins ont été récoltés, fixe et sectionnés pour la microscopie de fluorescence (objectif 40) tel que décrit à l’étape 2 du protocole. Montré sont trois lésions à proximité avec des niveaux variables de nuc-sGFP de la (A) et (B) sarAp1-tdTomato fluorescence. (C) l’acide nucléique de staphylocoques et hôte des cellules est indiqué par la coloration au DAPI. Les voies vertes et rouges sont fusionnés en (D). Des résultats similaires ont été observés dans d’autres sections. Les images ont été recueillies à l’aide d’un objectif 40 x ; Echelle = 25 µm. Les longueurs d’onde d’excitation pour les canaux de fluorescence sont les suivantes : DAPI, 405 nm ; GFP, 488 nm ; tdTomato, 561 nm. Fluorescence émise sont collectées sur une plage de longueurs d’onde : DAPI, 419-481 nm ; sGFP, 505-551 nm ; tdTomato, 575-630 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : NUC-sGFP est réglementée dans l’espace dans le micro-environnement des abcès staphylococcique. Confocal laser scanning des images de microscopie (CLSM) d’une lésion de communauté (SAC) abcès staphylococciques produites par Staphylococcus aureus souche LAC comptable nuc-sGFP et sarAp1-tdTomato journaliste fusions. Est indiqué le (A) fusionne les canaux pour nuc-sGFP et sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP fluorescence (vert), (C), DAPI souillure des acides nucléiques (bleus) et (D) sarAp1-tdTomato fluorescence (rouge). Les astérisques indiquent les cellules dans le noyau (centre de gravité) et les flèches indiquent les cellules à la périphérie. Les intensités de fluorescence (E) nuc -sGFP et (F) sarAp1-tdTomato sont indiquées pour les cellules dans le noyau et la périphérie du SAC. Les longueurs d’onde d’excitation pour les canaux de fluorescence sont les suivantes : DAPI, 405 nm ; GFP, 488 nm ; tdTomato, 561 nm. Fluorescence émise sont collectées sur une plage de longueurs d’onde : DAPI, 419-481 nm ; sGFP, 505-551 nm ; tdTomato, 575-630 nm. Les données proviennent de 8 reins (un par souris), et 1-2 lésions ont été imagées de chaque rein. Les barres indiquent la médiane. Ligne pointillée, limite de détection. Statistiques : une distribution normale des données, le test t de Student (impair), ***p < 0,05. (Barre d’échelle = 20 µm ; s’applique à toutes les images.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les maladies infectieuses bactériennes sont un problème croissant de santé dans le monde entier en raison de l’acquisition de la résistance aux antibiotiques déterminants46. Adaptation aux environnements hôtes étant essentielle pour la croissance et la survie au cours de l’infection, stratégies de ciblage des programmes d’expression de gènes qui augmentent l’aptitude de l’agent pathogène peuvent s’avérer utiles thérapeutiquement. Un de ces programmes est l’ensemble des gènes contrôlés par le système de deux composants de SaeR/S (TCS), décrite précédemment pour jouer un rôle essentiel dans l’évasion immunitaire47. SaeR/S est induite par une variété de facteurs, notamment celles associées aux neutrophiles8,20. Au cours de l’infection, S. aureus suscite une forte réaction inflammatoire dans lequel les neutrophiles et autres phagocytes sont recrutés sur le site de l’infection par2. Les dépôts de nécrose et fibrine liquéfaction suivre, formant un abcès pour prévenir d’autres dommages de tissu48. Parmi ces sites privilégiés immunitaires, cellules de S. aureus utilisent un certain nombre de produits de gènes Sae-dépendante pour reprogrammer l’abcès afin de faciliter la multiplication bactérienne5,,48. Un gène de Sae-dépendante, nuc, codes pour la nucléase et métabolise les filets pour produire 2'-désoxyadénosine pour tuer les macrophages43. Ainsi, Nuc est une enzyme sécrétée importante qui est essentiel pour la virulence complet42 et est exprimée en vivo (Figure 3, Figure 4et Figure 5).

Bien que les facteurs de virulence de S. aureus ont été étudiés intensivement, comment la bactérie se développe dans l’hôte est une zone peu étudiée, comme est de comprendre comment sa physiologie est régulée au cours de l’infection. Nous décrivons ici une méthode pour sonder l’expression des gènes bactériens et le comportement au niveau de la cellule unique utilisant un vecteur d’intégration mis à jour le qui atténue la préoccupation pour la perte de plasmide en l’absence de sélection. Notre méthodologie permet une visualisation directe de l’expression génique en abcès sans devoir permeabilize des parois cellulaires et sans la nécessité pour les anticorps et le marquage. Nous avons détecté une expression forte de la fusion de nuc-sGFP ainsi que la fusion de sarAp1-tdTomato en abcès rénal SACs formés par des cellules de type sauvage, trois jours après l’infection dans un modèle d’infection systémique aiguë. Toutefois, le protocole expérimental peut être modifié pour répondre aux questions au sujet de l’expression des gènes dans d’autres sites. En effet, parce que les souris C57BL/6 sont impossible d’effacer des S. aureus de leurs tissus, les bactéries envahissent divers sites anatomiques, y compris le système squelettique (OS et des articulations) et le cerveau, coeur, rate et le foie, qui ont tous une physiologie différente et propriétés nutritives5,49. Ainsi, une grande partie peut être apprise à l’aide de S. aureus pour sonder la nature des tissus de l’hôte. Il est important de noter qu’il est connu que certains créneaux d’hôte est hypoxique en nature ou autrement présentent un gradient d’oxygène forte50. Protéines fluorescentes ont besoin d’oxygène moléculaire pour l’activité, et certains sont plus sensibles que d’autres aux pressions partielles d’oxygène51. Alors que nous voyons la fluorescence du signal au fond de l’abcès, les amplitudes peuvent être sous-estimé. À l’aide de protéines fluorescentes codon optimisé destinés à Clostridium difficile pourrait servir à atténuer cette préoccupation52. Un deuxième point à noter est que les protéines fluorescentes (sGFP et tdTomato) produites par les journaliste de souches utilisées dans cette étude sont stables. Par conséquent, les données fluorescentes reflètent l’accumulation au cours de l’expérience plutôt qu’une réponse récente. Générant une construction contenant un sGFP instable ou tdTomato gène augmenterait considérablement l’utilitaire du système d’expériences dynamiques.

Le système décrit ici fournit un outil puissant pour étudier quantitativement gène règlement in vitro et in vivo. Parce que le journaliste est maintenu en seul exemplaire sur le chromosome, le système est bien adapté pour des gènes fortement exprimés (ce qui est, ayant une activité élevée promoteur). Gènes de biosynthèse ou autres gènes humbles peuvent ne pas apparaître parce que le niveau d’expression de fluorescence pourrait tomber sous le seuil de détection ou arrière-plan auto-fluorescence. On sait que le site de fixation du ribosome (RBS) influe sur l’activité de journaliste fusions33. Une solution à ce problème consiste à utiliser un RBS plus forts tels que la traduction initiation région (TIR)53 ou d’intégrer des copies en tandem des promoteurs d’intérêt dans le chromosome. Vous pouvez également stables copies plusieurs plasmides pourraient être utilisé54.

Une limitation de la méthode décrite est que, contrairement à une préparation de cDNA de l’ARN extrait les tissus, un nombre relativement restreint de gènes peut être interrogé en même temps (limité par des canaux fluorescents disponibles sans chevauchement spectrale). Cependant, il peuvent être potentiellement plus informatif de ce qui est acquis. qRT-PCR et autres lectures que la moyenne de la population en vrac sont incapables de capturer l’hétérogénéité de la population sur le site de l’infection. En effet, nous avons observé l’hétérogénéité du niveau de nuc-sGFP et sarAp1-tdTomato expression entre des lésions d’abcès à proximité (Figure 4). Ceci est similaire à ce qui a été récemment rapporté par Cassat et al. 55 en ce moment, l’origine de cette hétérogénéité n’est pas connue. Cependant, la disponibilité des nutriments, induction variable des systèmes d’acquisition de nutriments ou autres facteurs de l’hôte pourraient peut-être expliquer le phénomène. Par ailleurs, l’interaction hôte-pathogène survient dans les biocénoses des organes ou des abcès qui ont une structure tridimensionnelle complexe et divers types de cellules. Au sein de ces structures, les tissus peuvent varier considérablement en ce qui concerne le pH, osmolarité, oxygénation et de la disponibilité des nutriments, un phénomène appelé zonation métabolique56,,57. Nous avons découvert par hasard qu’un patron de régulation spatiale se pose dans les cellules de type sauvage qui résident dans l’abcès (Figure 5). Il s’agit à notre connaissance la première observation de ce type en un pathogène gram positif au cours de l’infection. La régulation spatiale rapporté ici est similaire à celle obtenue par Davis et al. dans le tissu splénique contenant des microcolonies du pathogène de Yersinia pseudotuberculosis58gram négatif. Dans ce cas, l’hôte produit l’oxyde nitrique (NO *) stimule la production d’oxyde nitrique dioxygénase (PGH) dans les cellules à la périphérie de la microcolonie plus proche de la diffusion NO *, épargnant l’intérieur des cellules qu’il fallait induire l’expression de PGH. En abcès staphylococciques, nuc expression est la plus forte à la base du SAC et les plus faibles le long de la périphérie. Parce que les abcès sont entourées d’un manchon de neutrophiles, il est tentant de spéculer que dérivé de neutrophile repères guident le comportement des staphylocoques, les cellules de polarisation dans deux populations phénotypiquement distinctes qui rappelle morphogéniques régulation de la différenciation au cours du développement dans la plus élevée de vie59. Le fondement mécaniste de ce modèle est inconnu et fait l’objet d’études approfondies dans notre laboratoire.

Nous croyons que notre méthode offre un outil efficace pour étudier le détail de l’expression génique dans des cellules individuelles au cours de l’infection. La méthode fournit une occasion unique d’observer et de comprendre par la suite les origines physiologiques de l’hétérogénéité et la structuration spatiale de l’expression génique dans les tissus. Ce comportement hétérogène doit tenir compte dans l’élaboration de nouvelles modalités de traitement, car seulement une sous-population de cellules (c'est-à-direceux exprimant les gènes) peut être visée par la thérapeutique.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous remercions Alexander Horswill pour le don de la PsarAP1tdTomato - fusion et Karen Creswell pour aide à l’analyse en cytométrie en flux. Nous remercions également Alyssa King pour obtenir des conseils sur l’analyse statistique. Ce travail a été financé en partie par une bourse de recherche exploratoire et le développement de NIH (fief AI123708) et les fonds de démarrage de faculté à SRB. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et interprétation ou la décision de soumettre les travaux pour publication.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

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