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Genetics

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

Abstract

Geni di virulenza batterica sono spesso regolati a livello trascrizionale da diversi fattori, che rispondono a differenti segnali ambientali. Alcuni fattori agiscono direttamente sui geni di virulenza; altri controllano patogenesi regolando l'espressione di regolatori a valle o l'accumulo di segnali che influiscono sull'attività del regolatore. Mentre il regolamento è stato studiato estesamente durante la crescita in vitro , relativamente piccolo è conosciuto circa come espressione genica è regolata durante l'infezione. Tali informazioni sono importanti quando il prodotto di un particolare gene è un candidato per l'intervento terapeutico. Trascrizionali approcci come RT-PCR quantitativa, in tempo reale e RNA-Seq sono potenti modi per esaminare l'espressione genica a livello globale, ma soffrono di molte sfide tecniche, tra cui scarsa abbondanza di RNA batterico rispetto al host RNA e campione degradazione di RNAsi. Valutazione regolamento utilizzando reporter fluorescenti è relativamente facile ed è canalizzabile con proteine fluorescenti con proprietà spettrali uniche. Il metodo consente analisi unicellulare, spazio-temporale dell'espressione genica in tessuti che presentano complessi gradienti di architettura e chimico-fisico tridimensionale che influiscono sulle reti di regolazione batteriche. Tali informazioni vengono perse quando i dati sono una media sopra la popolazione di massa. Qui, descriviamo un metodo per quantificare l'espressione genica in batteri patogeni in situ. Il metodo si basa sull'elaborazione di tessuto semplice e diretta osservazione della fluorescenza da proteine reporter. Dimostriamo l'utilità di questo sistema esaminando l'espressione di Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), prodotto del gene di cui è necessario per evasione immune e virulenza completo ex vivo e in vivo. Vi mostriamo quello nuc-gfp è fortemente espresso in Ascessi renali e rivelare espressione genica eterogenei dovuti in parte al regolamento apparente spaziale dell'attività del promotore nuc in ascessi pienamente impegnata con la risposta immunitaria. Il metodo può essere applicato a qualsiasi batterio con un sistema genetico manipolabile e qualsiasi modello di infezione, fornendo informazioni preziose per gli studi preclinici e lo sviluppo di farmaci.

Introduction

Batteri di rispondere alle mutevoli condizioni fisiologiche e alterazioni dello stato nutrizionale del loro ambiente esprimendo differenzialmente geni richiesti per la sopravvivenza e di adattamento. Per esempio, agenti patogeni opportunistici colonizzano corpo superfici a relativamente basso densità e spesso sono innocui. Tuttavia, una volta che il batterio ha penetrato le barriere fisiche e chimiche, esso deve vedersela con contro-difese ospite delle cellule immuni e limitata disponibilità nutriente1. Ad esempio, lo Staphylococcus aureus colonizza circa un terzo della popolazione senza sintomi ma è anche la causa della devastante della pelle e infezioni dei tessuti molli, osteomielite, endocardite e bacteremia2. Il successo di S. aureus come agente patogeno è spesso attribuito a sua flessibilità metabolica, nonché un arsenale di fattori di virulenza secrete e superficie-collegati che permettono il batterio sfuggire il flusso sanguigno e replicare nei tessuti periferici 3,4,5. Perché la morte di host a causa di malattia stafilococcica è un vicolo cieco dell'evoluzione e la trasmissione di limiti al nuovo host6, l'impegno per la produzione di fattore di virulenza deve essere controllato attentamente.

Una rete complessa regolamentazione di proteine e non-codificazione RNAs risponde ad una varietà di stimoli ambientali, tra cui cellulare densità, fase di crescita, fattori neutrofilo-collegati e disponibilità di nutrienti, per garantire che i geni di virulenza sono espresse alla tempo preciso e la posizione all'interno di host tessuti7,8,9,10,11,12,13. Per esempio, il sistema a due componenti SaeR/S (TCS) regola l'espressione di numerosi fattori di virulenza attraverso la chinasi di sensore (SaeS) e la risposta regolatore (SaeR)14. SaeS è autophosphorylated su un residuo di istidina conservata in risposta a host segnali (ad es., umana del neutrofilo peptidi [HNPs], calprotectina)8,15,16. Il gruppo fosforile viene poi trasferito ad un residuo di aspartato su SaeR, attivarlo come una proteina legante il DNA (SaeR ~ P)17. Il TCS SaeR/S regola oltre 20 geni che contribuiscono alla patogenesi tra cui proteine leganti di fibronectina (FnBPs), leukocidins e coagulasi14,18,19,20. Gli obiettivi possono essere classificati in ad alta affinità e bassa affinità geni bersaglio, che sono probabilmente indotta come il livello di SaeR ~ P aumenta quando esposti a suoi spunti21. L'attività di SaeR/S è controllata da altri regolatori dell'espressione genica, come ad esempio il sistema di rilevamento del quorum di Agr, repressore della proteina di tossine (Rot) e il fattore sigma alternativo B (SigB)22,23,24.

NUC è un gene di virulenza Sae-dipendente in stafilococco aureo e codifica thermonuclease (Nuc), che è essenziale per fuggire da neutrophilic einases traps (reti) e per diffusione durante il corso di infezione25,26. L'espressione di nuc è anche fortemente indirettamente repressa da CodY in presenza di aminoacidi a catena ramificata e GTP27e direttamente represso dalla proteina stafilococcica accessorio regolatore SarA28,29 , cui l'attività è influenzata da ossigeno (stato redox) e pH30. Dato che sae e nuc mutanti vengono attenuati in modelli murini di infezione, c'è interesse a sviluppare interventi chimici che inibiscono la loro corrispondente attività26,31. Nonostante questo, non c'è nessuna informazione per quanto riguarda la loro regolazione durante l'infezione.

Reporter fluorescenti sono stati utilizzati per monitorare e quantificare l'espressione genica a livello di singola cellula. Qui, presentiamo un metodo per quantificare S. espressione genica aureus durante l'infezione che, quando accoppiato con l'analisi del trascrittoma in vitro e potenti tecniche di imaging come la risonanza magnetica (MRI) e la spettroscopia a risonanza magnetica (MRS), può rivelare come batterica fisiologia è regolata in vivo e l'abbondanza relativa delle sostanze nutrienti in alcune nicchie. Il metodo può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico con un sistema genetico trattabile.

Panoramica del vettore integrativo del genoma.

PRB4 di vettore integrativo il genoma contiene 500 accoppiamenti bassi dalle regioni a Monte e a valle del pseudogene di S. aureus USA300 SAUSA300_0087 per facilitare la ricombinazione omologa. pRB4 è derivato dalla spina dorsale di vettore termosensibile pMAD contenente la cassetta di resistenza all'eritromicina (ermC) e beta-galattosidasi termostabile gene bgaB per lo screening blu/bianco di ricombinanti32. La costruzione del reporter ingegnerizzati contiene anche un indicatore di resistenza di cloramfenicolo (cat) per la selezione dopo l'integrazione del genoma ed eliminazione di plasmide, nonché siti EcoRI e SmaI di fondere la regione regolatrice di interesse al verde superfolder proteina fluorescente (sGFP) (Figura 1). È noto che la scelta del sito di legame del ribosoma (RBS) influenza l'attività del reporter e spesso richiede ottimizzazione empirica33. Così, un RBS non è fornito. Qui, il sito di legame del ribosoma nativo viene utilizzato per fornire per un modello più naturale di espressione genica, ma altri siti possono essere utilizzati.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Georgetown.

1. generazione del ceppo Reporter fluorescente

  1. Digerire il vettore di pRB4 integrativa del genoma in sequenza con enzimi di restrizione EcoRI e SmaI. Seguendo il protocollo del produttore, impostare una digestione durante la notte con SmaI utilizzando 1 µ g di pRB4 a 25 ° C e quindi procedere con la seconda digestione per 1h a 37 ° C con l'aggiunta di EcoRI alla miscela di reazione. Inattivare gli enzimi incubando a 65 ° C per 20 min.
  2. PCR amplificano la regione regolatrice di interesse dal DNA genomico (in questo caso, un coppia di basi ~ 350 frammento di DNA contenente la regione del promotore thermonuclease [nuc]), che incorpora un sito di restrizione EcoRI 5' e un sito di restrizione SmaI 3'. La sequenza di riconoscimento SmaI deve essere in-frame con il codone di inizio traslazionale. In questo studio, la PCR è stata effettuata utilizzando una polimerasi del DNA ad alta fedeltà secondo le raccomandazioni del produttore con forward primer oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') e reverse primer oRB016 ( 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). La temperatura di annealing era 53 ° C. Purificare il frammento risultante utilizzando un kit di pulizia PCR seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Digerire il prodotto PCR risultante con EcoRI e SmaI interpretato nel passaggio 1.1 e legare il frammento di DNA digerito agli stessi siti di pRB4 utilizzando la ligasi del DNA T4 come consigliato dal produttore per generare il costrutto integrativo. Introdurre la miscela di legatura in Escherichia coli e confermare la sequenza di costrutto.
  4. Electroporate il costrutto in ceppo S. aureus RN4220 come descritto in precedenza34. In breve, utilizzare 1 µ g del plasmide con 70 µ l di cellule electro-competenti (Ω 100, 25 µF e 2,3 kV) in brodo di B2 (1% [p/v] idrolizzato di caseina, Estratto di lievito 2,5% [p/v], 2,5% [p/v] NaCl, 0,1% [p/v] K2PO4, 0,5% [p/v] glucosio). Selezionare per resistenza all'eritromicina (Emr) alla temperatura permissiva (30 ° C) su agar soia triptico (TSA) completati con eritromicina (5 µ g mL-1) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µ g mL-1). La risultante trasformanti sono blu a causa di attività della β-galattosidasi plasmide-codificati.
    Nota: Trasferimento di DNA in isolati clinici è estremamente difficile a causa di una forte restrizione-modificazione barriera35. Così, RN4220 di S. aureus è stato utilizzato come un destinatario intermedio del costrutto fusione perché è restrizione carenti e altamente trasformabile.
  5. Trasferimento del plasmide in S. aureus USA300 ceppo di interesse usando elettroporazione o trasduzione dei fagi-mediata36 alla temperatura permissiva. In breve, propagare batteriofago di11 Φ particelle sul ceppo donatore utilizzando piastre TSA contenenti 5 mM CaCl2 pernottamento a 30 ° C e quindi sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro di siringa di 0,45 µM di acetato di cellulosa. Utilizzare lisati di trasdurre S. aureus ceppo LAC a Emr.
    Nota: LAC è un ampiamente usato isolato clinico è stato effettuato in precedenza Em sensibili dal passaggio seriale nel mezzo di TSB per curare il ceppo del pUSA03 di nativo plasmide che conferisce Emr 37,38.
  6. Consente di integrare il cromosoma come descritto in precedenza32il costrutto da due, eventi di ricombinazione omologa successivi. I ricombinanti sono cloramfenicolo-resistenti (Cmr) sulle piastre TSA contenente 5 μg mL-1 di cloramfenicolo, eritromicina-sensibili (Erms) e non più blu.
    Nota: Quando possibile, reintrodurre la fusione contrassegnata in USA300 tramite trasduzione mediata dei fagi per evitare l'accumulo di mutazioni associate a ceppo in vitro passaggio39 e temperatura turni.

2. animale infezione: Preparazione del inoculo, infezione sistemica e processazione dei tessuti

  1. Preparazione dell'inoculo batterico
    1. Striscia di ceppi di Staphylococcus aureus di interesse per l'isolamento su piastre di agar sangue da uno stock di glicerolo congelati. Incubare a 37 ° C per 16 – 24 ore confermare emolitici fenotipi basati sulla loro capacità di lisare cellule di anima rosse (RBCs) e forma trasparente zone libere.
    2. Avviare una notte culture inoculando singole colonie di ogni ceppo a 4 mL di brodo di soia triptico (TSB) in tubi di vetro sterile. Ruotare le provette a 37 ° C per 16 – 24 h in un tubo rullo fissato a circa un angolo di 70° e 70 giri al minuto [RPM].
    3. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) delle culture dal punto 2.1.2. Utilizzare mezzo sterile come un riferimento ottico (vuoto). Diluire queste cellule a un OD600 di 0.05 in 25 mL di sterile Tryptic Soy brodo (TSB) in separato, 125 mL DeLong boccette (5:1 boccetta in rapporto al volume) e incubare le colture in un bagno d'acqua (per trasferimento di calore adeguata alle culture), agitazione a 280 giri/min e impostare a 37 ° C.
      Nota: La crescita dell'inoculo può essere eseguita in vari modi; viene presentato un metodo per la coltivazione di cellule in fase esponenziale. Indipendentemente da ciò, è importante utilizzare sempre lo stesso metodo per preparare le celle per inoculazione.
    4. A un OD600 ~ 1, ri-diluire le cellule in mezzo fresco per una partenza OD600 di 0.05 affinché le cellule raggiungere fase esponenziale e che i fattori che si accumulano durante l'incubazione overnight sono state ridotte a livelli di fase esponenziale.
    5. Raccogliere le cellule durante la fase esponenziale (OD600 ~0.6–0.8) mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    6. Lavare il pellet due volte in volume equivalente di sterile 1x tampone fosfato salino (PBS; pH 7.4).
    7. Sospendere le cellule in 1X PBS (pH 7.4) ad una concentrazione di 1 x 108 Colonia formando unità (CFUs) mL-1 o più appropriata per il desiderato sperimentare.
      Nota: è importante determinare la relazione tra OD600 e CFU mL-1 per ogni ceppo di interesse perché ceppo-dipendente alterazioni di forma e dimensioni delle cellule possono influire sulle proprietà di dispersione della luce e, in definitiva, il dose di infezione.
  2. Preparazione degli animali e delle infezioni batteriche
    1. Acclimatare topi per 7 giorni dieta purificata AIN-93. La dieta è formulata per fornire una nutrizione adeguata, riducendo tessuto auto-fluorescenza associato al consumo di ingredienti vegetali utilizzati in mouse standard chow40.
      Nota: I topi C57/BL6 femminili (6-8 settimane) sono usati qui, ma il topo e il sesso dipenderà lo studio.
    2. Prima dell'infezione, si dilatano le vene di coda di topo con acqua tiepida.
    3. Infettare animali iniettare 100 µ l dell'inoculo batterico tramite coda-vene per produrre un'infezione sistemica. Salvare un'aliquota dell'inoculo iniziale se eseguendo la citometria a flusso (Vedi sezione 4).
    4. Monitorare gli animali ogni giorno e valutare il loro stato di salute utilizzando un sistema di monitoraggio ha esaminato e approvato dai propri istituzionali Animal Care e Comitato di uso.
    5. Permettere che l'infezione al progresso per la durata desiderata. Qui, gli esperimenti sono terminati 3 giorni dopo l'infezione.
      Nota: In queste condizioni, gli ascessi consistono di una comunità di ascesso stafilococcico di batteri, racchiuso da depositi di fibrina e circondato da strati concentrici di cellule immuni5,41.
  3. Raccolta dei organi e processazione dei tessuti
    1. Gli animali da inalazione di CO2 e dislocazione cervicale come metodo secondario di eutanasia ed eseguire l'autopsia.
    2. Raccolta rene (a destra) e altri organi vitali (cuore, fegato, polmoni, milza) e trasferire in provette di polipropilene di 15 mL contenente formalina al 10% [v/v] tamponata. Procedere con questi organi a passo 2.3.4 qui sotto.
    3. Trasferire il rene di sinistra ad un tubo resistente agli urti sterile 2 mL contenente ~ 500 µ l di 2 mm silice perline e sterile 1 x di 1 mL di PBS (pH 7.4). Procedere con questo organo al punto 4.2.
    4. Consentire gli organi dal punto 2.3.2 per fissare al buio a temperatura ambiente con agitazione delicata o rotazione per almeno 24 ore ma non più di 48 ore.
    5. Incorporare gli organi in tessuto chiaro medio di congelamento e memorizzare i tessuti a-80 ° C.
    6. Utilizzando un criostato, sezione tessuto in fette dello spessore di 10 µm.
    7. Asciugare le sezioni su una lastra di vetro pre-pulito, carica per 20 min nel buio, applicare liquido di montaggio rigido con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) macchia e coprire con vetrino coprioggetto. Curare le diapositive montate a temperatura ambiente durante la notte e trasferimento a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.

3. microscopia confocale a scansione ed elaborazione di immagini del laser

  1. Esaminare diapositive montate per individuare lesioni mediante laser appropriato per il reporter fluorescente utilizzato. In questo caso, il verde (GFP), rosso (tdTomato) e fluorescenza blu (DAPI) segnali vengono utilizzati.
  2. Acquisire l'immagine utilizzando l'obiettivo appropriato per la visualizzazione di singole celle (ad esempio, in genere x 20 o 40 x obiettivi vengono utilizzati).
  3. Misurare l'intensità di fluorescenza nelle immagini confocale.
    1. Aprire l'immagine confocale in immagine J e regolare la luminosità/contrasto per visualizzare correttamente il segnale di fluorescenza della lesione.
    2. Definire l'area di interesse e utilizzando l'opzione soglia , impostare i limiti inferiori e superiori di fluorescenza come necessario.
    3. Definire il centroide selezionando Area → valore grigio medio → centroide → limitare alla soglia sotto la scheda analizza di J. immagine
    4. Estrarre il valore di intensità di fluorescenza centroide o misurare l'intensità media di fluorescenza in una lesione determinata per unità di superficie (intensità media di fluorescenza, MFI) per GFP e tdTomato. Qui, le zone di one µm2 sono state usate.
      Nota: Una seconda analisi accecata minimizza bias quando è nota l'identità del campione.
    5. Tracciare i dati ed eseguire analisi statistiche appropriate per ogni confronto.

4. analisi di citometria a flusso di

  1. (Opzionale) Determinare l'attività di fusione dell'inoculo il giorno dell'infezione (dalla sezione 2.2.3)
    1. A 899 µ l di 1X PBS sterile (pH 7.4) aggiungere 100 µ l di ciascun inoculo e 1 µ l di acido nucleico permeante membrana macchia (Vedi Tabella materiali). Come controllo, assicurarsi di includere un campione privo di acido nucleico macchia.
    2. Eseguire citometria a flusso su tutti i campioni.
      Nota: Per il primo esperimento, è utile includere un controllo unico vettore per la fusione di interesse per determinare la tensione corretta da utilizzare. Una netta separazione tra i campioni positivi e negativi è essenziale per l'analisi dei dati, che indica il reporter è ben di sopra di segnale di fondo.
    3. Per identificare la popolazione batterica, tracciare gli eventi usando acido nucleico macchia (asse y) e forward scatter (asse x).
    4. Disegnare un cancello di inclusione nei dintorni di eventi che sono entrambi acido nucleico macchia positiva e la dimensione corretta del batterio basato sul forward scatter (tra 0,5 a 2,0 µm per S. aureus).
      Nota: Essere rigorosi nell'identificazione di questa popolazione come è fondamentale per includere gli eventi che sono chiaramente all'interno di questi parametri. Essere sicuri di che questo cancello esclude tutti gli eventi per i controlli negativi in altre condizioni. In questo studio, circa il 70% la popolazione delle cellule ha incontrato questi requisiti nell'analisi.
  2. Analisi dei campioni di tessuto dopo sacrificio:
    1. Eutanasia degli animali, raccogliere i reni di sinistro (Vedi punto 2.3) e trasferimento nel tallone-pestaggio tubi contenenti 1 mL di 1X PBS sterile (pH 7,4) e 250 µ l di perle di borosilicato di 2 mm.
    2. Interferire con tessuti per rilasciare cellule batteriche. Per i reni, è necessario utilizzare un omogeneizzatore per distruggere le cellule. Qui, tre 30 s scoppia a 6800 giri con 1 min periodi su ghiaccio bagnato tra i cicli di raffreddamento sono stati utilizzati per ridurre al minimo il riscaldamento campioni.
    3. Pellet i detriti più grandi di tessuto mediante centrifugazione a 250 x g per 3 min in una microcentrifuga da tavolo raffreddato a 4 ° C.
      Nota: In genere, c'è un pellet cellulare nella parte inferiore del tubo e uno strato di detriti galleggianti in alto a sinistra. Lo strato acquoso centrale contiene le cellule batteriche.
    4. Trasferire 10 µ l dello strato acquoso in una microcentrifuga pulito 1,5 mL contenente 1 µ l di acido nucleico macchia nel 989 µ l di PBS (volume totale 1 mL).
    5. Eseguire la citometria di flusso utilizzando gli stessi parametri di acquisizione dati e gating per quanto riguarda l'inoculo iniziale.
      Nota: I conteggi delle cellule batteriche sarà molto bassi perché il campione contiene principalmente i detriti del tessuto. L'opzione "Live gate" è utilizzabile anche se le cellule sono acido nucleico macchia positiva e dimensione-gated quando i dati vengono caricati nell'applicazione. Questo aiuterà anche per analizzare più degli eventi desiderati e ridurre la dimensione del file. Eventi quasi 1 milione per campione sono contati, ma ulteriori conteggi di evento possono essere necessari a seconda della gravità dell'infezione e la dimensione del tessuto analizzato.
    6. Analisi dei dati: Determinare media intensità di fluorescenza (MFI) per ogni fluoroforo in un dato campione utilizzando le porte di inclusione determinate al punto 4.1.4. Normalizzare i campioni nel software di analisi di flusso per i conteggi di evento. 10.000 conteggi sono solitamente sufficienti nell'analisi.
      Nota: Non è raro trovare esempi che contengono meno di questo numero di eventi, poiché questo dipende dalla gravità di infezione e di formazione di ascesso. Utilizzando questo approccio, 500-40.000 eventi si trovano tipicamente in tessuto infetto.

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Representative Results

Abbiamo sviluppato un plasmide derivato da pMAD32 in grado di fornire qualsiasi giornalista fusione costrutto nel cromosoma di ricombinazione omologa doppio crossover (Figura 1). Questo costrutto consente analisi quantitativa di qualsiasi regione regolatrice che sostiene la produzione di proteina GFP e segnale fluorescente sopra priorità bassa. Il plasmide conferisce resistenza all'ampicillina (Apr) per la manutenzione e la propagazione in e. coli e conferisce resistenza all'eritromicina (Emr) in S. aureus. Il costrutto anche conferisce resistenza al cloramfenicolo (Cmr), che consente per un facile trasferimento della fusione integrata reporter tra vari ceppi mutanti per sofisticate analisi genetica in S. aureus.

Come prova di principio, abbiamo fuso il nuc regione regolatrice di gfp. nuc è stato scelto perché il prodotto del gene è necessario per la piena virulenza ed è necessario per limitare i macrofagi da s. aureus-indotta da ascessi42, 43. Il costrutto è stato integrato nel cromosoma come descritto nei passaggi 1.4-1.6 del protocollo. La fusione integrata fu poi trasferita a AH3926 che contiene una fusione di - tdTomatosarAP1P. Il sarA promotore P1 è stato indicato in precedenza per essere costitutivamente attivo44 ed etichette così, tutte le celle.

Abbiamo innanzitutto verificato che le fusioni di reporter erano attivi durante in vitro agitare crescita boccetta in brodo di soia triptico (TSB; un medium ricco, complesso) e che i livelli di fluorescenza erano sopra lo sfondo auto-fluorescente cellulare (Figura 2). Per determinare il comportamento in vivo il reporter fluorescenti, un modello modificato ascesso renale era usato5. Gruppi di topi femminili C57BL/6 sono stati sfidati per via endovenosa con 1 x 107 CFU ciascuna delle cellule di S. aureus LAC carente fusioni reporter o le cellule LAC fusioni sia il nuc-sGFP e sarAp1-tdTomato . Gli animali sono stati sacrificati tre giorni post infezione. Poi, raccolto gli organi sono stati fissati in formalina al 10% [v/v] tamponata, cryo-sezionato e imaged mediante microscopia confocale dopo colorazione DAPI come descritto in passaggi 2 e 3 (Figura 3A, B). Le immagini sono state analizzate utilizzando Image J e fluorescenza per unità di superficie nelle lesioni renali è stata misurata. Come illustrato nella Figura 3C, fluorescenza fusione nuc-gfp è stato in media quasi 9-fold superiore in cellule che trasportano la fusione che in cellule che non trasportano la fusione di reporter; il segnale di quest'ultimo costituisce il limite di rilevazione (auto-fluorescenza) (confronta nuc-sGFP a LAC). Allo stesso modo, è stata la fluorescenza di fusione di PsarAP1- tdtomato ~ 6 volte superiori a nessun controllo di reporter (Figura 3E, confronta sarAP1- tdT vs LAC). Mediante citometria a flusso, il modello di attività del reporter è stato confermato usando gli omogeneati del rene e flusso cytometry come descritto nel passaggio 4, anche se la piega le differenze nella fluorescenza era più basso (Figura 3S, F).

È interessante notare che, i dati di fluorescenza da lesioni formate da cellule che trasportano le fusioni reporter fluorescente è sembrato mostrare maggiore variabilità rispetto a quelli privi i reporter. Ci siamo chiesti se la variazione nelle misure di fluorescenza osservata era dovuto l'espressione eterogenea dei giornalisti (vale a dire, di origine biologica). Infatti, a distanza di ~ 100 µm è stato trovato che alcune lesioni espresso uno o entrambi i giornalisti (Figura 4). D'importanza, esaminando l'attività del reporter con risoluzione di singola cellula nelle comunità di ascesso stafilococcico (SACs) ha rivelato spaziale regolazione dell'espressione di nuc in ascessi circoscritto con forte colorazione DAPI, probabilmente connesso con la formazione e il rilascio di neutrofili extracellulari trappole (Figura 5A-C)45. Per esempio, abbiamo misurato la fluorescenza di fusione nuc-sGFP significativamente più alto nel nucleo interno del SAC rispetto a quella alla periferia (Figura 5B, E). L'ascesso stesso, il modello per fluorescenza di fusione sarAp1-tdTomato sembrava essere invertito(Figura 5). Tuttavia, il modello non era statisticamente significativo utilizzando lo stesso numero di animali (Figura 5F).

Figure 1
Figura 1 : Rappresentazione schematica del genoma integrativa reporter plasmide pRB4. Plasmide pRB4 è un derivato del pMAD con un origine sensibile di temperatura di replicazione in S. aureus (Ori pE194ts). Ci sono tre marcatori di resistenza di droga: (i) bla, che conferisce resistenza all'ampicillina in Escherichia coli; (ii) ermC, che conferisce resistenza all'eritromicina in S. aureus; e (iii) gatto, che conferiscono resistenza al cloramfenicolo in S. aureus. La costruzione del reporter è affiancata da ~ 500 bp ogni dalle sequenze a Monte e a valle di pseudogene SAUSA300_0087 (genoma di riferimento: FPR3757) per doppio crossover omologa di ricombinazione e genoma integrazione. gene della proteina fluorescente sGFP, verde; CS, clonazione sito; TT, terminatore trascrizionale forte bidirezionale. Figura non è in scala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Ho Gest NUC-sGFP e sarAp1-tdTomato i giornalisti sono espressi durante lo sviluppo in vitro . S. aureus LAC cellule (selvaggio-tipo [WT]), con e senza la (A) nuc -sGFP o (B) sarAp1-tdTomato reporter) erano cresciute a una fase esponenziale TSB e ri-diluite nel mezzo stesso. Densità ottica (OD) e fluorescenza sono stati misurati i valori di densità ottica indicato. I valori di intensità di fluorescenza di fondo-sottratto (eccitazione/emissione: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT], 535/590 nm) sono stati divisi per i valori di densità ottica per generare unità Relative di fluorescenza. I dati sono i mezzi + /-SEM da due esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Reporter fluorescenti sono visibili nel tessuto renale. Gruppi di 13 topi C57BL/6 sono stati sfidati per via endovenosa con celle LAC o LAC che trasportano sia nuc-sGFP e sarAp1-tdTomato (tdT), e l'infezione è stato permesso di procedere per tre giorni. Topi sono stati sacrificati, e gli organi sono stati elaborati come descritto nei passaggi 2 e 3 del protocollo. Sezione di rene rappresentante mostrando le lesioni multiple e la fluorescenza associata per (A) nuc-sGFP e (B) sarAp1-tdTomato. Scala bar = 250 µm (obiettivo 10x). La relativa unità di fluorescenza per unità di superficie (RFU [μm2]-1) associato a lesioni renali sono state misurate utilizzando analisi dell'immagine, come descritto al punto 3.3 e sono state tracciate per (C) nuc-sGFP e (E) sarAp1-tdTomato; ogni punto rappresenta una lesione e le barre indicano la mediana; 3-5 lesioni analizzate per topo. Analisi di citometria a flusso (D) nuc-sGFP e fluorescenza di fusione sarAp1-tdTomato (F) in popolazioni batteriche isolate da Rene infetto omogeneati tre giorni post infezione. L'intensità di fluorescenza significa (MFI) è indicato dalla barra solida, e ogni punto è un rene. LAC, reporterless sforzo di tipo selvatico. Statistiche: Test di Mann-Whitney; p < 0.05. I dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. Le lunghezze d'onda di eccitazione per i canali di fluorescenza sono come segue: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Fluorescenza emessa dati sono stati raccolti in un intervallo di lunghezze d'onda: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Gli ascessi mostrano espressione variabile di reporter in tessuti renali. Gruppi di 13 topi C57BL/6 sono stati sfidati con 1 x 107 CFU delle cellule di S. aureus via vena caudale. Gli animali sono stati eutanasizzati tre giorni post infezione. I reni sono state raccolte, fisso e sezionati per microscopia a fluorescenza (obiettivo 40x) come descritto nel passaggio 2 del protocollo. Vengono mostrati tre lesioni in stretta vicinanza con livelli variabili di nuc-sGFP di (A) e (B) sarAp1-tdTomato fluorescenza. (C) dell'acido nucleico da stafilococchi e host è indicato cellule macchiando il DAPI. I canali rossi e verdi si fondono in (D). Risultati simili sono stati osservati in altre sezioni. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 40x; Barra della scala = 25 µm. Le lunghezze d'onda di eccitazione per i canali di fluorescenza sono come segue: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Fluorescenza emessa dati sono stati raccolti in un intervallo di lunghezze d'onda: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : NUC-sGFP nello spazio è regolato nell'ascesso stafilococcico micro-ambiente. Scansione di immagini di microscopia (CLSM) di una lesione di comunità (SAC) di ascesso stafilococcico prodotto da S. aureus ceppo LAC trasportante nuc-sGFP sarAp1-tdTomato reporter fusioni e confocale del laser. Vengono mostrati la (A) fuse canali per nuc-sGFP e sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP fluorescenza (verde), (C) DAPI colorazione degli acidi nucleici (blu) e (D) sarAp1-tdTomato fluorescenza (rosso). Gli asterischi indicano le cellule nel nucleo (centroide) e le frecce indicano le cellule alla periferia. L'intensità di fluorescenza per (E) nuc -sGFP e (F) sarAp1-tdTomato sono indicati per le cellule nel nucleo e periferia del SAC. Le lunghezze d'onda di eccitazione per i canali di fluorescenza sono come segue: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Fluorescenza emessa dati sono stati raccolti in un intervallo di lunghezze d'onda: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. I dati sono derivati dai 8 reni (uno per topo), e 1-2 lesioni erano imaged da ciascun rene. Le barre indicano la mediana. Linea tratteggiata, limite di rilevazione. Statistiche: distribuzione normale dei dati, test t di Student (spaiati), * * *p < 0.05. (Barra della scala = 20 µm; si applica a tutte le immagini.) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Malattie infettive batteriche sono un crescente problema di salute in tutto il mondo grazie all'acquisizione di determinanti di resistenza agli antibiotici46. Perché adattamento ad ambienti host è essenziale per la crescita e la sopravvivenza durante l'infezione, strategie basati su programmi di espressione genica che aumentano la forma fisica agente patogeno possono risultare utile terapeuticamente. Uno di questi programmi è l'insieme dei geni controllati dal sistema bicomponente SaeR/S (TCS), mostrato in precedenza per svolgere un ruolo essenziale nell'evasione immune47. SaeR/S è indotta da una varietà di fattori, in particolare quelli connessi con i neutrofili8,20. Durante l'infezione, S. aureus suscita una forte risposta infiammatoria in cui neutrofili e altri fagociti sono reclutati nel sito di infezione2. Deposizione di necrosi e fibrina di liquefazione seguire, formando un ascesso per impedire ulteriore danno di tessuto48. All'interno di questi siti privilegiati immuni, S. aureus le cellule usano un numero di prodotti genici Sae-dipendente per riprogrammare l'ascesso per facilitare la moltiplicazione batterica5,48. Un gene di Sae-dipendente, nuc, codici per nucleasi e metabolizza le reti per la produzione di 2'-deossiadenosina per uccidere i macrofagi43. Così, Nuc è un importante enzima secernuto che è essenziale per la virulenza completo42 ed è espressa in vivo (Figura 3, Figura 4e Figura 5).

Anche se i fattori di virulenza di S. aureus sono stati studiati estesamente, come il batterio cresce nell'ospite è un'area Zito, come è capire com'è regolata la sua fisiologia durante l'infezione. Qui descriviamo un metodo per il sondaggio di espressione genica batterica e il comportamento a livello di singola cellula utilizzando un vettore integrativo modificato che mitiga la preoccupazione per la perdita del plasmide in assenza di selezione. La nostra metodologia consente la visualizzazione diretta dell'espressione genica in ascessi senza dover permeabilize le pareti cellulari e senza la necessità per gli anticorpi e l'etichettatura. Abbiamo rilevato la forte espressione di fusione nuc-sGFP così come la fusione di sarAp1-tdTomato in ascesso renale SACs formata da cellule wild-type tre giorni post infezione in un modello di infezione sistemica acuta. Tuttavia, il disegno sperimentale può essere modificato per rispondere a domande riguardanti l'espressione genica in altri siti. Infatti, poiché i topi C57BL/6 sono Impossibile cancellare S. aureus da loro tessuti, i batteri invadono varie sedi anatomiche tra cui il sistema scheletrico (ossa e articolazioni) e il cervello, cuore, milza e fegato, dotate di fisiologia differente e proprietà nutritive5,49. Così, molto si può apprendere tramite S. aureus per sondare la natura dei tessuti dell'ospite. È importante notare che è noto che determinate nicchie di host sono hypoxic in natura o altrimenti esibiscono un gradiente di ossigeno forte50. Le proteine fluorescenti richiedono ossigeno molecolare per attività, e alcuni sono più sensibili alle pressioni parziali di ossigeno rispetto ad altri51. Mentre vediamo la fluorescenza del segnale profondo all'interno dell'ascesso, le grandezze possono essere una sottostima. Utilizzando proteine fluorescenti codone-ottimizzato e sviluppate per l'uso in Clostridium difficile potrebbe essere utilizzato per attenuare questa preoccupazione52. Un secondo punto da notare è che le proteine fluorescenti (sGFP e tdTomato) prodotte da ceppi reporter utilizzati in questo studio sono stabili. Pertanto, i dati fluorescenti riflettono accumulo nel corso dell'esperimento, piuttosto che una risposta di recente. Generando un costrutto contenente un gene di tdTomato o di sGFP instabile aumenterebbe notevolmente l'utilità del sistema per esperimenti di dinamici.

Il sistema di reporter qui descritto fornisce un potente strumento per studiare quantitativamente regolazione genica in vitro e in vivo. Perché il reporter viene mantenuto in singola copia del cromosoma, il sistema è particolarmente adatto per geni fortemente espressi (che è, avendo l'attività del promotore alta). Geni biosintetici o altri geni espressi in umile potrebbero non essere visibile perché il livello di espressione di fluorescenza potrebbe cadere sotto il limite di rilevamento o priorità bassa auto-fluorescenza. È noto che il sito di legame del ribosoma (RBS) influenza l'attività di giornalista fusioni33. Una possibile soluzione a questo problema è utilizzare una RBS più forte come la traduzione iniziazione regione (TIR)53 o per integrare il cromosoma copie tandem dei promotori di interesse. In alternativa, stabile multi-copia plasmidi potrebbero essere usato54.

Una limitazione del metodo descritto è che, a differenza di una preparazione di cDNA da RNA estratto dai tessuti, un numero relativamente piccolo di geni possa essere interrogato simultaneamente (limitato di canali disponibili fluorescenti senza sovrapposizione spettrale). Tuttavia, ciò che è guadagnato può essere potenzialmente più informativo. qRT-PCR e altre letture che media la popolazione di massa sono in grado di catturare eterogeneità della popolazione presso il sito di infezione. Infatti, abbiamo osservato eterogeneità nel livello di nuc-sGFP , e l'espressione di sarAp1-tdTomato fra le lesioni di ascesso in prossimità (Figura 4). Questo è simile a quello che è stato recentemente segnalato da Cassat et al. 55 in questo momento, l'origine di questa eterogeneità non è conosciuta. Tuttavia, la disponibilità di nutrienti, induzione variabile dei sistemi di acquisizione dei nutrienti o altri fattori dell'ospite potrebbero possibilmente spiegare il fenomeno. Inoltre, l'interazione ospite-patogeno si verifica all'interno di microambienti di organi o ascessi che hanno struttura tridimensionale complessa e vari tipi di cellule. All'interno di queste strutture, i tessuti possono variare notevolmente rispetto al pH, osmolarità, ossigenazione e disponibilità di nutrienti, un fenomeno noto come metabolica zonazione56,57. Abbiamo scoperto serendipitously che un modello di regolamento spaziale si presenta in cellule wild-type che risiedono nell'ascesso (Figura 5). Questo è a nostra conoscenza la prima osservazione del suo genere in un agente patogeno gram-positivo durante l'infezione. Il regolamento spaziale segnalato qui è simile a quella ottenuta da Davis et al. in tessuto splenico contenente microcolonies del patogeno gram-negativo la pseudotuberculosi di Yersinia58. In quel caso, host prodotta dell'ossido di azoto (n *) ha stimolato la produzione di ossido nitrico diossigenasi (Hmp) in cellule alla periferia della microcolony più vicina per il diffusore NO *, risparmiatori interni cellule la necessità di indurre l'espressione di hmp. In ascessi stafilococcici, espressione di nuc è più forte il cuore del SAC e più deboli lungo la periferia. Perché gli ascessi sono circondati da un polsino di neutrofili, si è tentati di speculare che neutrofilo-derivati spunti guidano il comportamento degli stafilococchi, polarizzando le cellule in due popolazioni distinte fenotipicamente ricordano morfogenetico regolazione della differenziazione durante lo sviluppo in maggiore vita59. La base meccanicistica di questo modello è sconosciuta ed è oggetto di intenso studio nel nostro laboratorio.

Crediamo che il nostro metodo fornisce uno strumento efficace per studiare il dettaglio fine dell'espressione genica in cellule individuali durante l'infezione. Il metodo fornisce un'opportunità unica per osservare e capire finalmente le origini fisiologiche di eterogeneità e patterning spaziale dell'espressione genica in tessuti. Questo comportamento eterogeneo deve essere preso in considerazione durante lo sviluppo di nuove modalità di trattamento, come solo una sottopopolazione delle cellule (cioè, quelli che esprimono i geni) può essere mirata di terapeutico.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Ringraziamo Alexander Horswill per il dono della fusione di PsarAP1- tdTomato e Karen Creswell per aiuto con l'analisi di citometria a flusso. Ringraziamo anche Alyssa King per consigli sull'analisi statistica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da un premio di ricerca esplorativi/Developmental NIH (grant AI123708) e fondi di avvio facoltà di SRB. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dei dati e interpretazione o la decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

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References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

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