Une méthode axée sur la Fluorescence pour étudier la régulation des gènes bactériens dans les tissus infectés

Summary

Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

Abstract

Les gènes de virulence bactérienne sont souvent réglementés au niveau transcriptionnel par de multiples facteurs qui répondent aux différents signaux environnementaux. Certains facteurs agissent directement sur les gènes de virulence ; d’autres contrôlent la pathogénie en ajustant l’expression des régulateurs en aval ou l’accumulation de signaux qui affecte l’activité de l’organisme de réglementation. Alors que le règlement a été largement étudiée au cours de la croissance in vitro , on connaît relativement comment l’expression des gènes est ajustée au cours de l’infection. Ces informations sont importantes lorsque le produit d’un gène particulier est un candidat pour une intervention thérapeutique. Transcriptionnels approches comme la RT-PCR quantitative, en temps réel et RNA-Seq sont de puissants moyens pour étudier l’expression des gènes au niveau mondial, mais souffrent de nombreux défis techniques, y compris de faible abondance d’ARN bactérien par rapport à l’hôte ARN et échantillon dégradation par les RNases. Évaluation de règlement à l’aide de reporters fluorescents est relativement facile et peut être multiplexé avec des protéines fluorescentes ayant des propriétés spectrales uniques. La méthode permet une analyse unicellulaires, spatio-temporelle de l’expression génique dans les tissus qui présentent des dégradés architecture et physiochimiques tridimensionnelles complexes qui influent sur les réseaux de régulation bactériens. Ces informations sont perdues lorsque les données sont en moyenne sur la population en vrac. Ici, on décrit une méthode pour la quantification de l’expression de gène dans les bactéries pathogènes in situ. La méthode repose sur le traitement de tissus simples et l’observation directe de la fluorescence des protéines de journaliste. Nous démontrent l’utilité de ce système en examinant l’expression de Staphylococcus aureus Thermonucléase (nuc), dont le produit génique est requis pour évasion immunitaire et virulence complet ex vivo et in vivo. Nous montrons que nuc-gfp est fortement exprimé dans les abcès rénales et révéler l’expression des gènes hétérogène due en partie à apparent règlement spatiale de l’activité de promoteur nuc en abcès pleinement engagée avec la réponse immunitaire. La méthode peut être appliquée à toute bactérie avec un système génétique balayages et de n’importe quel modèle d’infection, fournir des informations précieuses pour les études précliniques et développement de médicaments.

Introduction

Bactéries répondent à l’évolution des conditions physiologiques et les modifications de l’état nutritionnel de leur environnement de façon différentielle exprimant des gènes nécessaires à l’adaptation et la survie. Par exemple, des agents pathogènes opportunistes colonisent les corps des surfaces à relativement faible densité et sont souvent inoffensifs. Cependant, une fois que la bactérie a pénétré les barrières physiques et chimiques, il doit composer avec Counter-défenses des cellules immunitaires de l’hôte et de la disponibilité restreinte des nutriments¹. À titre d’exemple, Staphylococcus aureus colonise environ le tiers de la population de façon asymptomatique, mais est également la cause de dévastateur de la peau et des tissus mous, ostéomyélite, endocardite et bactériémie². Le succès S. aureus comme un pathogène est souvent attribué à sa flexibilité métabolique, mais aussi un arsenal de facteurs de virulence de surface associées et sécrétées qui permettent à la bactérie d’échapper à la circulation sanguine et se répliquer dans les tissus périphériques ^3,4,5. Parce que l’hôte mort due à une maladie staphylococcique est une impasse évolutive et la transmission de limites aux nouveaux hôtes⁶, l’engagement à la production de facteur de virulence doit être soigneusement contrôlée.

Un réseau complexe de réglementation des protéines et répond d’ARN non codants à une variété de stimuli environnementaux, y compris de cellules densité, phase de croissance, facteurs associés à neutrophile et disponibilité des nutriments, pour s’assurer que les gènes de virulence sont exprimées à la heure exacte et l’emplacement au sein de l’hôte tissus^{7,8,9,10,11,12,13}. Par exemple, le système à deux composants SaeR/S (TCS) régule l’expression de plusieurs facteurs de virulence par la kinase de capteur (SaeS) et la réponse régulateur (SaeR)¹⁴. SaeS est autophosphorylated sur un résidu histidine conservée en réponse à l’hôte des signaux (par exemple, human neutrophiles peptides [HNPs], calprotectine)^8,15,16. Le groupe phosphoryle est ensuite transféré dans un résidu aspartate sur SaeR, activant ce dernier comme une protéine de liaison à l’ADN (SaeR ~ P)¹⁷. Le SDC SaeR/S réglemente plus de 20 gènes qui contribuent à la pathogénèse, y compris les protéines de liaison de la fibronectine (FnBPs), leukocidins et staphylocoques à coagulase^14,18,19,20. Cibles peuvent être classées en haute affinité et de faible affinité gènes cibles, qui sont probables induit que le niveau de SaeR ~ P augmente lorsqu’ils sont exposés à ses repères²¹. L’activité de SaeR/S est contrôlée par les autres organismes de réglementation de l’expression des gènes tels que le système de détection de quorum Agr, répresseur de protéine de toxines (Rot) et l’autre facteur sigma B (SigB)^22,23,24.

NUC est un gène de virulence de Sae-dépendante chez Staphylococcus aureus et encode la Thermonucléase (Nuc), qui est essentiel pour échapper à neutrophilic emi tpa (filets) et pour la diffusion au cours de la cours de l’infection de^25,26. L’expression du nuc est également fortement indirectement réprimée par CodY en présence d’acides aminés à chaîne ramifiée et GTP²⁷et directement réprimée par la protéine staphylococcique accessoires régulateur SarA^28,29 , dont l’activité est influencée par l’oxygène (état d’oxydoréduction) et pH³⁰. Étant donné que les mutants sae et nuc sont atténués dans les modèles de souris de l’infection, il y a intérêt à développer des interventions chimiques qui inhibent leur correspondant activités^26,31. Malgré cela, il n’y a aucune information au sujet de leur règlement au cours de l’infection.

Fluorescents reporters ont été utilisés pour surveiller et quantifier l’expression des gènes au niveau de la cellule unique. Ici, nous présentons une méthode de quantification de la S. aureus l’expression des gènes au cours de l’infection qui, lorsqu’il est associé avec analyse du transcriptome in vitro et puissantes techniques d’imagerie comme l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la spectroscopie par résonance magnétique (SRM), peuvent révéler comment bactérienne la physiologie est réglementée in vivo et l’abondance relative des éléments nutritifs dans certains créneaux. La méthode peut être appliquée à toute bactérie pathogène avec un système génétique tractable.

Vue d’ensemble du vecteur génomique intégrative.

La génomique intégrative vecteur pRB4 contient 500 paires de bases chaque des régions en amont et en aval de la pseudogène USA300 de Staphylococcus aureus SAUSA300_0087 pour faciliter la recombinaison homologue. pRB4 est dérivé de l’épine dorsale le vecteur thermosensibles pMAD contenant la cassette de résistance à l’érythromycine (ermC) et bêta-galactosidase thermostable gène bgaB pour le dépistage de bleu/blanc de recombinants³². La journaliste ingénierie construction contient également un marqueur de résistance de chloramphénicol (cat) pour la sélection après l’intégration du génome et élimination de plasmide, ainsi que des sites EcoRI et SmaI à fusionner la région régulatrice d’intérêt au vert superfolder protéine fluorescente (sGFP) (Figure 1). On sait que le choix du site de liaison du ribosome (RBS) influe sur l’activité du reporter et exige souvent empiriques optimisation³³. Ainsi, un RBS n’est pas fourni. Ici, le site de fixation du ribosome native est utilisé pour fournir un modèle plus naturel de l’expression des gènes, mais les autres sites peuvent être utilisés.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Georgetown. 1. génération de la souche de journaliste Fluorescent Digérer le vecteur d’intégration pRB4 génome séquentiellement avec les enzymes de restriction EcoRI et SmaI. Suivant le protocole du fabricant, mis en place une digestion au jour le jour avec la SmaI à l’aide de 1 µg de pRB4 à 25 ° C et ensuite procéder à la secon…

Representative Results

Nous avons développé un plasmide dérivé pMAD32 qui peut fournir n’importe quel journaliste construct de fusion dans le chromosome par recombinaison homologue double filtre (Figure 1). Cette construction permet d’analyse quantitative de toute région régulatrice qui prend en charge la production de la protéine GFP et signal fluorescent au-dessus de fond. Le plasmide confère la résistance à l’ampicilline (Apr) p…

Discussion

Les maladies infectieuses bactériennes sont un problème croissant de santé dans le monde entier en raison de l’acquisition de la résistance aux antibiotiques déterminants⁴⁶. Adaptation aux environnements hôtes étant essentielle pour la croissance et la survie au cours de l’infection, stratégies de ciblage des programmes d’expression de gènes qui augmentent l’aptitude de l’agent pathogène peuvent s’avérer utiles thérapeutiquement. Un de ces programmes est l’ensemble des g?…

Materials

5% sheep blood	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
confocal laser scanning microscope	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Flow Analyzer	Becton Dickinson	NA
glass beads	Sigma	Z273627
Miniprep, plasmid	Promega	A1220
orbital shaking water bath	New Brunswick Innova	NA
PCR purification	QIagen	28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plate reader	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriction Enzymes	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero clear tissue freezing medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
Syringe, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptic Soy Broth	VWR	90000-376
UV-visible spectrophotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500