Dyrkning af grøn mikroalger i boble kolonne Photobioreactors og en analyse for Neutral lipider

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at konstruere lab-skala boble kolonne photobioreactors og bruge dem til kultur mikroalger. Det giver også en metode til bestemmelse af kultur vækstrate og neutral lipid indhold.

Abstract

Der er betydelig interesse for studiet af mikroalger til engineering applikationer såsom fremstilling af biobrændsel, højværdiprodukter, og til behandling af affald. Som de fleste nye forskningsindsats begynder på laboratoriet skala, er der behov for omkostningseffektive metoder til dyrkning mikroalger på en reproducerbar måde. Her, kommunikerer vi en effektiv tilgang til kultur mikroalger i laboratoriet-skala photobioreactors, og at måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Vejledningen er også medtaget på hvordan man opsætter photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismer er arter af Chlorella og Auxenochlorella, kan dette system tilpasses for at dyrke en bred vifte af mikroalger, herunder Co kulturer af alger med ikke-alger. Stock kulturer dyrkes først i flasker til at producere inokulum for photobioreactor system. Alger inokulum er koncentreret og overført til photobioreactors til dyrkning i batch-mode. Prøver indsamles dagligt for absorbansaflæsningerne. For enden af batch kultur celler er høstet af centrifuge, vasket, og fryse tørrede at opnå en endelig tørvægt koncentration. Den endelige tørvægt koncentration bruges til at skabe en sammenhæng mellem den optiske tæthed og tørvægt koncentration. En modificeret Folch metode bruges efterfølgende til at udtrække samlede indhold af lipider fra den frysetørrede biomasse og ekstraktet er analyseret for sin neutrale lipid indhold ved hjælp af en mikrotiterplade assay. Denne analyse har været offentliggjort tidligere, men protokollen trin indgik her for at fremhæve vigtige trin i den procedure, hvor der ofte opstår fejl. Den bioreaktor system beskrevet her udfylder en niche mellem simple kolbe dyrkning og fuldt kontrolleret kommercielle bioreaktorer. Selv med kun 3-4 biologiske replikater per behandling, vores tilgang til dyrkning af alger fører til stramme standardafvigelser i vækst og lipid-assays.

Introduction

Anvendelsen af mikroalger i ingeniør- og bioteknologi har tiltrukket sig stor interesse i de seneste år. Mikroalger er undersøgt til brug i spildevand behandling^1,2,3,4, biobrændstof produktion^5,6,7,8, og den produktion af nutraceuticals og andre høje værdi produkter^9,10. Alger er også er genetisk modificerede til højere priser i et forsøg på at forbedre deres egnethed til specifikke tekniske applikationer^11,12. Der er derfor stor interesse i eksperimenter med industrielt relevante organismer i kontrolleret indstillinger. Formålet med denne metode er at kommunikere en effektiv tilgang til kultur mikroalger i et kontrolleret laboratoriemiljø og måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Forbedre vækst priser og neutral lipid indhold af mikroalger er blevet identificeret som to centrale flaskehalse mod kommercialisering af alger biobrændstoffer¹³.

En bred vifte af tilgange har været brugt til kultur alger til forsøgsformål. Generelt er kan disse tilgange opdeles mellem store udendørs dyrkningen og små indendørs dyrkning. Udendørs dyrkningen i photobioreactors og åben damme er egnet til eksperimenter med henblik på optrapning af processer, der allerede er blevet påvist i laboratoriet målestok (f.eks., at teste skala-up af en ny high-lipid stamme af alger)¹⁴. Dog, indendørs små dyrkning er relevant ved udviklingen af nye eller forbedrede alger stammer eller udføre eksperimenter til formål at forstå biologiske mekanismer. I disse sidstnævnte tilfælde kræves en høj grad af eksperimentelle kontrol at drille subtile ændringer i biologiske opførsel. Med henblik herpå, er axenic kulturer ofte nødvendige for at minimere de komplekse biotiske faktorer i forbindelse med andre organismer (fx bakterier og andre alger), der uundgåeligt vokser i store udendørs systemer. Selv når man studerer interaktioner blandt alger og andre organismer, har vi fundet, at brug af stærkt kontrollerede forsøgsbetingelser er nyttigt, når undersøge molekylære udveksling mellem organismer^15,16,17.

Inden for kategorien af mindre indendørs alger dyrkning, har været brugt en vifte af tilgange. Måske er den mest almindelige metode at dyrke alger i Erlenmeyerkolben kolber på en shakerbord under en lys bank^18,19. Udvekslingen af ilt og CO₂ finder sted ved passiv diffusion gennem en skum prop i toppen af kolben. Nogle forskere har forbedret dette set-up gennem aktive beluftning af kolberne²⁰. En anden metode er at dyrke alger i flasker, mixet af rør bar og aktive beluftning. Trods deres enkelhed, har vi fundet, at brug af flasker og flasker ofte fører til inkonsistente resultater blandt biologiske replikater. Formentlig skyldes holdning effekter – forskellige positioner modtager forskellige mængder af lys, som også berører intern reaktor temperaturer. Daglige rotation af reaktorer til nye stillinger kan hjælpe, men ikke afhjælpe problemet, fordi visse faser af algevækst (fx tidligt eksponentiel) er mere følsomme over for positionelle effekter end andre (fx log fase).

På den modsatte side af spektret af teknologisk sofistikerede er fuldt kontrolleret kommercielle photobioreactors. Disse systemer løbende overvåge og justere forholdene i reaktoren til at optimere algevækst. De programmerbare lys, real-time temperaturkontrol og pH kontrol. Desværre, de er dyre og koster typisk flere tusinde dollars pr. reaktor. Mest videnskabelige og tekniske tidsskrifter kræver biologiske replikering af resultater, hvilket kræver køb af flere bioreaktorer. Vi præsenterer her en boble kolonne reaktor system at broer kløft mellem simple (kolbe) og sofistikerede (fuldt kontrolleret bioreaktor) tilgange til lab-skala alger dyrkning. Boble kolonner bruger stigende gasbobler til at lette gasudveksling og bland reaktoren. Denne fremgangsmåde giver en vis grad af styring af belysning og temperatur men gør det på en måde, der er omkostningseffektive. Desuden har vi fundet dette system til at give meget ensartede resultater blandt biologiske replikater, at reducere det nødvendige antal biologiske replikater nødvendige for at opnå statistisk signifikante resultater i forhold til metoden kolbe eller flaske. Vi har også brugt dette system med succes dyrker blandinger af alger og bakterier²¹. Foruden alger dyrkning skitsere vi en procedure til måling af neutrale lipid indhold i de dyrkede alger. Sidstnævnte metode har været offentliggjort andetsteds²², men vi omfatter proceduren her for at give en trinvis vejledning til, hvordan du anvender det med succes.

Protocol

1. opsætning af boble kolonne Photobioreactors Konstruere en række udluftet låg fra plast låg, der fulgte med 1 L glasflasker og hybridisering rør (Se figur 1 for skematisk og fotos). Konstruere låg luftfugter, blande fælde, hver luft lift photobioreactor og hver flaske reaktor. Bore ¼” huller i låget: 2 huller er nødvendige for bioreaktor og luftfugter låg; 3 huller er nødvendige for at blande fælde. Slip en ¼” O-ring over trådene i en 1/8″ panel …

Representative Results

Denne procedure giver et tidsforløb af alge ekstinktionen data på OD 550 nm (figur 4A). Optisk tæthed og tørvægt koncentration data kan være korreleret (figur 4B). Dette opnås ved første beregning af den endelige tørvægt alger koncentration efter de freeze-drying trin. Næste, Ekstinktionen af kultur seriel fortynding (udføres på den sidste dag i prøvetagning) og de faktiske tørvægt koncentrationer kan være korrel…

Discussion

Den vigtigste overvejelse ved dyrkning af alger er en forståelse af de specifikke behov i organismen eller gruppe af organismer. Algerne dyrkning system beskrevet her kan bruges til kultur en bred vifte af alger, men de specifikke abiotiske faktorer (temperatur, medier, pH, lysintensitet, CO₂ niveau, beluftning sats) skal tilpasses til behovene, som skadegøreren. Bemærk de parametre, der beskrives her blev anvendt til dyrkning af Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismer er af industr…

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles	Corning	16157-191	For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp	Home Depot	UC953A	or equivalent
1/4" female luer to barb	Nordson biomedical	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-244	50'
1/4" in O-rings	Grainger	1REC5	#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb	Nordson biomedical	FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-608	250'
1/8" male spinning luer to barb	Nordson biomedical	MLRL013-6005
1/8" multiport barb	Nordson biomedical	4PLL230-6005	1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb	Nordson biomedical	18230-6005	1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer	Nordson biomedical	Nordson MLRLB230-6005	1/8", PP
10 gallon fish tank	Walmart	802262	Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter	Dwyer	RMA-13-SSV	For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank	Agrobrite	FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-14-SSV	For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles	Corning	16157-136	For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-12-SSV	For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter	Dwyer	RMA-151-SSV	For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm	Whatman/ Fisher	09-745-1A	Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves	VWR	89094-714
Corning lids for pyrex bottles	VWR	89000-233	10 GL45 lids
Female luer endcap	Nordson biomedical	Nordson FTLLP-6005	Female stable PP
Hybridization tubes	Corning	32645-030	35×300 mm, pack of 2
Light timer	Walmart	556393626
Locknuts	Nordson biomedical	Nordson LNS-3	1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer	VWR	10153-690	Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap	Nordson biomedical	Nordson LP4-6005	Male plug PP
Spinning luer lock ring	Nordson biomedical	Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long	VWR	58949-040	38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium	VWR	58949-034	25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters	VWR	28145-491	13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes	Air-tite	89215-216	For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes	VWR	87003-294	Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes	Greiner Bio-One	82050-482	Sterile (or equivalent)
100 mm plates	VWR	25384-342	100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-276	Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips	Greiner Bio-One	82051-584	Sterile (or equivalent)
2 mL tubes	VWR	87003-298	Sterile (or equivalent)
50 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-348	Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate	Greiner Bio-One	89089-578	Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops	VWR	80094-478	Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator	Airgas	CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes	VWR	10158-556	Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates	Greiner Bio-One	82050-774	Polypropylene, flat bottom
Bleach	Walmart	550646751	Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform	BDH	BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol	BDH	BDH1133-1LP
Methanol	BDH	BDH20864.400
Nile red	VWR	TCN0659-5G
Pasteur pipette tips	VWR	14673-010
Sodium chloride	BDH	BDH9286-500G
Vegetable oil	Walmart	9276383	Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)	Biospec products	11079105z
Equipment
Analytical balance	Mettler-Toledo	XS205DU	Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer	Omni	19-040E
Benchtop micro centrifuge	Thermo	Heraeus Fresco 21 with 24×2	Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater	VWR	75838-282	Including dry block for a microplate
Freeze dryer	Labconco	7670520	2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge	Thermo	Heraeus Megafuge 16R Tissue	Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer	VWR	10153-838