Summary

中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培

Published: January 07, 2019
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Summary

ここでは、ラボスケール バブル列フォトバイオリアクターを構築および微細藻類培養に使用するプロトコルを提案する.文化成長率と中性脂質含量の定量のためのメソッドも提供します。

Abstract

廃棄物処理、バイオ燃料、高付加価値製品の製造などエンジニア リング アプリケーションのための微細藻類の研究に大きな関心があります。ほとんどの新しい研究努力は、実験室規模で開始、再現可能な方法で微細藻類を培養するためのコスト効果の高い方法の必要性があります。ここでは、我々 は微細藻類培養実験室規模フォトバイオリアクターと成長、その藻の中性脂質含量を測定するための効果的な方法を伝えます。指示は、フォトバイオリアクター システムを設定する方法についても含まれます。例の生物がクロレラAuxenochlorellaの種、幅広い非藻類種の藻類の共培養を含む微細藻類を育成するこのシステムを合わせることができます。株式文化最初フォトバイオリアクターにおける菌の生成するボトルで栽培しています。藻類は集中し、フォトバイオリアクター バッチ モードでの栽培のために転送。サンプルは光学濃度測定のため毎日収集されます。バッチ文化の終わり、セル洗浄、遠心分離機による収穫、凍結乾燥、最終的な乾燥重量濃度。最終的な乾燥重量濃度を使用して、光学濃度と乾燥重量濃度の間の相関関係を作成します。Folch 法の改良はその後凍結乾燥バイオマスから総脂質を抽出するため、抽出物はマイクロ プレート法を用いた中性脂質内容の検定します。このアッセイは、以前公開されているが、プロトコルの手順は、エラーが頻繁に発生する重要な手順を強調するここに含まれていた。ここで説明したバイオリアクター システムは、単純なフラスコ栽培と商業のバイオリアクターを完全に制御のニッチを埋めます。治療あたり 3-4 生物だけでも複製、藻類を培養へのアプローチは、成長と脂質の試金でタイトな標準偏差に 。

Introduction

工学とバイオ テクノロジーで微細藻類のアプリケーションは、近年大きな関心を集めています。微細藻類が排水処理1,2,3,4、バイオ燃料生産5,6,7,8で使用するため研究されていると栄養補助食品・その他価値の高い製品9,10の生産。藻類も遺伝的変更される大きい率で特定のエンジニア リング アプリケーションの11,12の健康を改善するために。その結果、制御された設定で工業的に関連する生物の実験には大きな関心があります。このメソッドの目的は、管理された実験室では、文化の微細藻類に効果的なアプローチし成長とその藻の中性脂質含量を測定します。成長の改善率と微細藻類の中性脂質含量は13藻類バイオ燃料の実用化に向けた 2 つのキーのボトルネックとして識別されています。

幅広いアプローチは実験目的のため藻類培養に使用されています。一般に、これらのアプローチは大規模屋外栽培と小規模の屋内栽培の分けることができます。フォトバイオリアクターと開いている池で屋外栽培は実験室規模 (例えば藻類の新種高脂質のスケール アップをテストするため) に既に実績のあるプロセスをスケール アップを目的とした実験に適した14。ただし、屋内の小規模栽培は適切な新規または改善された藻類系統の開発時または生物学的メカニズムを理解することを目的とした実験を行います。これらの後者の場合生物学的態度の微妙な変化を引き出す心理学実験制御の高度が必要です。そのため、無菌共生栽培多くの場合必然的に大規模な屋外における拡張他の生物 (例えば細菌、他の藻類) に関連付けられている複雑な生物的要因を最小限に抑えるために必要があります。藻類や他の生物間の相互作用を学ぶ時でさえ、分子生物15,16,17交流を調べる実験条件の高度制御の使用が役立つことがわかりました。

小規模な屋内藻類栽培のカテゴリ内でのアプローチの範囲が使用されています。おそらく最も一般的なアプローチは、光銀行18,19下シェーカー テーブルの上のエルレンマイヤー フラスコで藻を成長することです。フラスコの上部に泡のプラグインを介して受動拡散によって酸素と CO2の交換が行われる。一部の研究者は、フラスコ20のアクティブな通気によってこの設定を改善しています。攪拌棒とアクティブな通気によって混合ボトルで藻類を育成する方法です。そのシンプルさにもかかわらず、我々 はフラスコやボトルの使用がしばしば生物複製間の一貫性のない結果につながることを発見しました。おそらくこれは位置の影響によるものです – 別の位置を受け取るまた炉内温度に影響を与える光の量が異なる。新しい位置に原子炉の毎日のローテーションは助けることが問題を軽減しないので藻類の成長の特定の段階 (例えば、早期指数) 他 (例えば、ログ フェーズ) よりポジショニング エフェクトにより敏感します。

技術的に洗練されたスペクトルの反対側にある商業のフォトバイオリアクターを完全に制御これらのシステムは継続的に監視し、藻類の成長を最適化するために原子炉で条件を調整します。プログラム可能な照明、リアルタイム温度コントロール、および pH コントロールがあります。残念なことに、彼らは高価であり、通常原子炉あたり数千ドルの費用。最も科学的なおよび工学のジャーナルは複数バイオリアクターの購入を施行した結果の生物学的レプリケーションを必要とします。ここでは提示バブル列原子炉システム シンプル (フラスコ) と高度 (バイオリアクターの完全に制御) 間の格差ラボ スケール藻類栽培へのアプローチその橋。ガス交換を促進し、原子炉をミックスする気泡上昇気泡列を使用します。このアプローチは、照明と温度制御のある程度を提供しますがコスト効率の高い方法で 。さらに、我々 はフラスコやボトルのアプローチと比較して統計的に有意な結果を得るために必要な生物学的複製の必要数を減らすこと生物的複製の間で非常に一貫した結果が得られるこのシステムを発見しました。また正常に藻類と細菌21の混合物を育成するこのシステムを使いました。藻類栽培に加えて培養藻の中性脂質含量を測定するための手順の概要を説明します。後者の方法はされている22、他の場所で公開されたが、我々 は正常にそれを使用する方法の詳細な手順を提供するためにここでプロシージャを含めます。

Protocol

1. 気泡列フォトバイオリアクターのセットアップ 1 リットルのガラス瓶やハイブリダイゼーション チューブ (回路図と写真の図 1を参照) に付属しているプラスチックの蓋から通気孔のある蓋のセットを構築します。加湿器、混合トラップ、各空気リフト フォトバイオリアクターと各ボトル原子炉の蓋を構築します。 ¼”蓋に穴をあける: バイオリアクター?…

Representative Results

この手順には、外径 550 nm (図 4 a) 藻類の光学密度データの時間コースが得られます。光学濃度と乾燥重量集中できるデータに関連する (図 4 b)。これは、最初に凍結乾燥のステップの後の最終的な乾燥重量藻類濃度計算で。次に、実際の乾燥重量濃度と文化シリアル希釈 (サンプリングの最後の日に実行されます) の光学密?…

Discussion

藻類を培養する際に最も重要な生物または生物のグループの特定のニーズを理解しています。藻類が特定の非生物的要因 (温度、メディア、pH、光量、CO2レベルの通気率) の広い範囲の文化をここで説明した栽培システムを使用ことができます藻類は生物のニーズを調整する必要があります。クロレラAuxenochlorellaの耕作のために使用されたここで説明したパラメーター?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究のためのサポートは、米国農務省国立食品研究所と農業ハッチ プロジェクト ALA0HIGGINS、学長、研究では、副社長とサミュエル モビルジン工学大学のオーバーン大学のオフィスによって提供されました。サポートは、NSF によって提供されたもあわせて 1438211 を付与します。

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles Corning 16157-191 For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp Home Depot UC953A or equivalent
1/4" female luer to barb Nordson biomedical Nordson FTLL360-6005 1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-244 50'
1/4" in O-rings Grainger 1REC5 #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb Nordson biomedical FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing Thermo-Nalgene 63013-608 250'
1/8" male spinning luer to barb Nordson biomedical MLRL013-6005
1/8" multiport barb Nordson biomedical 4PLL230-6005 1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb Nordson biomedical 18230-6005 1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer Nordson biomedical Nordson MLRLB230-6005 1/8", PP
10 gallon fish tank Walmart 802262 Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter Dwyer RMA-13-SSV For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank Agrobrite FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter Dwyer RMA-14-SSV For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles Corning 16157-136 For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter Dwyer RMA-12-SSV For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter Dwyer RMA-151-SSV For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm Whatman/ Fisher 09-745-1A Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves VWR 89094-714
Corning lids for pyrex bottles VWR 89000-233 10 GL45 lids
Female luer endcap Nordson biomedical Nordson FTLLP-6005 Female stable PP
Hybridization tubes Corning 32645-030 35×300 mm, pack of 2
Light timer Walmart 556393626
Locknuts Nordson biomedical Nordson LNS-3 1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer VWR 10153-690 Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap Nordson biomedical Nordson LP4-6005 Male plug PP
Spinning luer lock ring Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long VWR 58949-040 38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium VWR 58949-034 25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters VWR 28145-491 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes Air-tite 89215-216 For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes VWR 87003-294 Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes Greiner Bio-One 82050-482 Sterile (or equivalent)
100 mm plates VWR 25384-342 100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes Greiner Bio-One 82050-276 Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips Greiner Bio-One 82051-584 Sterile (or equivalent)
2 mL tubes VWR 87003-298 Sterile (or equivalent)
50 mL tubes Greiner Bio-One 82050-348 Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate Greiner Bio-One 89089-578 Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops VWR 80094-478 Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator Airgas CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes VWR 10158-556 Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates Greiner Bio-One 82050-774 Polypropylene, flat bottom
Bleach Walmart 550646751 Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform BDH BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide BDH BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol BDH BDH1133-1LP
Methanol BDH BDH20864.400
Nile red VWR TCN0659-5G
Pasteur pipette tips VWR 14673-010
Sodium chloride BDH BDH9286-500G
Vegetable oil Walmart 9276383 Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) Biospec products 11079105z
Equipment
Analytical balance Mettler-Toledo XS205DU Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer Omni 19-040E
Benchtop micro centrifuge Thermo Heraeus Fresco 21 with 24×2 Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater VWR 75838-282 Including dry block for a microplate
Freeze dryer Labconco 7670520 2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge Thermo Heraeus Megafuge 16R Tissue Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax M2 Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer VWR 10153-838

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Cite This Article
Wang, Q., Peng, H., Higgins, B. T. Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids. J. Vis. Exp. (143), e59106, doi:10.3791/59106 (2019).

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