Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

Summary

Hier presenteren we een protocol om te bouwen van lab-schaal zeepbel kolom photobioreactors en ze gebruiken om cultuur microalgen. Het biedt ook een methode voor de bepaling van de groeisnelheid van de cultuur en de neutrale vetgehalte.

Abstract

Er is aanzienlijke interesse in de studie van microalgen voor waterbouwkundige toepassingen zoals de productie van biobrandstoffen, hoogwaardige producten, en voor de behandeling van afval. Zoals de meeste nieuwe onderzoeksinspanningen op laboratoriumschaal beginnen, is er behoefte aan een kosteneffectieve methoden voor het kweken van microalgen op een reproduceerbare wijze. Hier, communiceren we een effectieve benadering van cultuur microalgen in laboratoriumschaal photobioreactors en de groei en de neutrale vetgehalte van die algen te meten. Instructies vindt u ook op het instellen van het photobioreactor-systeem. Hoewel de organismen voorbeeld soorten Chlorella en Auxenochlorella zijn, kan dit systeem worden aangepast om het kweken van een breed scala van microalgen, met inbegrip van co culturen van algen met niet-algen soorten. Stamculturen worden eerst gekweekt in flessen te produceren van entmateriaal voor het photobioreactor-systeem. Algen entmateriaal is geconcentreerd en overgedragen aan photobioreactors voor de teelt in de batchmodus. Monsters worden dagelijks verzameld voor de gemeten optische dichtheid. Aan het einde van de batch-cultuur, cellen worden geoogst door centrifuge, gewassen, en gedroogd tot een droge eindgewicht verwachte concentratie aan bevriezen. De droge eindgewicht concentratie wordt gebruikt voor het maken van een correlatie tussen de optische dichtheid en de concentratie van het drooggewicht. Een gemodificeerde Folch methode wordt vervolgens gebruikt om totale lipiden uittreksel uit de gevriesdroogde biomassa en het extract is vehiculumcontrolegroep haar neutrale vetgehalte met behulp van een microplate-assay. Deze bepaling heeft eerder gepubliceerd maar protocol stappen waren hier om te markeren van kritische stappen in de procedure waar fouten vaak voorkomen. Het systeem van de bioreactor hier beschreven vult een niche tussen eenvoudige kolf teelt en volledig gecontroleerde commerciële bioreactoren. Zelfs met slechts 3-4 biologische repliceert per behandeling, onze benadering van het kweken van algen leidt tot strakke standaarddeviaties in de groei en lipide testen.

Introduction

De toepassing van microalgen in engineering en biotechnologie heeft aangetrokken veel belangstelling in de afgelopen jaren. Microalgen worden bestudeerd voor gebruik in afvalwater behandeling,^1,2,3,4, biobrandstof productie^5,6,7,8, en de productie van nutraceuticals en andere hoogwaardige producten^9,10. Algen zijn ook wordt genetisch gemodificeerde tegen grotere prijzen in een poging om hun geschiktheid voor specifieke technische toepassingen^11,12te verbeteren. Er is dus grote belangstelling voor experimenten met industrieel relevante organismen in gecontroleerde instellingen. Het doel van deze methode is een doeltreffende benadering van cultuur microalgen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving communiceren en voor het meten van de groei en de neutrale vetgehalte van die algen. Verbetering van groei tarieven en neutrale vetgehalte van microalgen zijn geïdentificeerd als twee grote knelpunten richting van commercialisering van algen biobrandstoffen¹³.

Een breed scala van benaderingen zijn gebruikt om cultuur algen voor experimentele doeleinden. In het algemeen, kunnen deze benaderingen worden verdeeld tussen grootschalige outdoor teelt en kleinschalige binnen kweek. Outdoor teelt in photobioreactors en open vijvers is geschikt voor experimenten gericht op schaalvergroting van processen die reeds hebben bewezen op laboratoriumschaal (bijvoorbeeld voor het testen van schaal-up van een nieuwe hoge-lipide-stam van algen)¹⁴. Echter binnen kleinschalige teelt geschikt bij het ontwikkelen van nieuwe of verbeterde algen stammen is of het uitvoeren van experimenten gericht op het begrip biologische mechanismen. In deze laatste gevallen moet een hoge mate van experimentele controle plagen uit subtiele veranderingen in de biologische werking. Te dien einde zijn een culturen vaak nodig om te minimaliseren van de complexe biotische factoren die samenhangen met andere organismen (bijvoorbeeld bacteriën, en andere algen) die onvermijdelijk in grootschalige outdoor systemen groeien. Zelfs bij de studie van interacties tussen algen en andere organismen, die we hebben gevonden dat gebruik van hoogst-gecontroleerde experimentele omstandigheden nuttig is bij de behandeling van moleculaire uitwisseling tussen organismen^15,16,17.

Binnen de categorie van kleinschalige indoor algen teelt en een aantal benaderingen zijn gebruikt. Misschien is de meest voorkomende benadering groeien algen in conische kolven op een shaker tafel onder een lichte bank^18,19. Uitwisseling van zuurstof en CO₂ vindt plaats door passieve diffusie door middel van een stekker schuim in de top van de kolf. Sommige onderzoekers hebben deze set-up via actieve beluchting van de kolven²⁰verbeterd. Een andere aanpak is het kweken van algen in flessen, gemixt door roer bar en actieve beluchting. Ondanks hun eenvoud, hebben we vonden dat het gebruik van flacons en flessen vaak tot een inconsistente resultaten van biologische replicaat-organismen leidt. Vermoedelijk is dit te wijten aan de positie effecten – verschillende posities krijgen verschillende hoeveelheden van het licht, die ook van invloed op interne reactor temperaturen. Dagelijkse rotatie van reactoren naar nieuwe posities kan helpen, maar is niet het probleem verlichten omdat bepaalde fases van de groei van algen (bijvoorbeeld vroeg exponentiële) zijn gevoeliger voor positionele effecten dan anderen (bijvoorbeeld log fase).

Aan de andere kant van het spectrum van technologische geavanceerdheid zijn volledig gecontroleerde commerciële photobioreactors. Deze systemen voortdurend controleren en aanpassen van de omstandigheden in de reactor voor het optimaliseren van de groei van algen. Ze hebben programmeerbare verlichting, real-time temperatuurregeling en pH-control. Helaas, ze zijn duur en typisch kosten duizenden dollars per reactor. Meest wetenschappelijke en technische tijdschriften vereisen biologische replicatie van resultaten, waardoor de aankoop van meerdere bioreactoren. Wij presenteren hier een zeepbel kolom reactor systeem dat de kloof tussen de eenvoudige (kolf) en geavanceerde (volledig gecontroleerde bioreactor) benaderingen voor lab-schaal algen teelt bruggen. Bubble kolommen kunnen stijgende gasbellen gas uitwisseling en meng de reactor. Deze aanpak biedt een zekere mate van controle over de verlichting en de temperatuur, maar doet dit op een manier die rendabel. Bovendien hebben we gevonden dit systeem zeer consistente resultaten van biologische replicaat-organismen, vermindering van het vereiste aantal biologische replicatieonderzoeken noodzakelijk zijn voor het verkrijgen van statistisch significante resultaten in vergelijking met de kolf of fles aanpak. Ook hebben we dit systeem gebruikt te kweken mengsels van algen en bacteriën²¹. Naast de teelt van algen schetsen we een procedure voor het meten van de neutrale vetgehalte in de gekweekte algen. De laatste methode is gepubliceerd elders²², maar ook hier de procedure om te bieden stapsgewijze instructies voor het met succes gebruiken.

Protocol

1. installatie van Bubble kolom Photobioreactors Bouw van een aantal ontlucht deksels van de kunststof deksels die kwam met de 1 L glazen flessen en kruising buizen (Zie Figuur 1 voor schema en foto’s). Deksels voor de luchtbevochtiger, mengen elke fles reactor, val en elke air lift photobioreactor te bouwen. Boorgaten ¼” in het deksel: 2 gaten zijn nodig voor bioreactor en luchtbevochtiger deksels; 3 gaatjes zijn nodig voor de mengen val. Slip een ¼” O-ring ov…

Representative Results

Deze procedure levert een tijdsverloop van algen optische dichtheid gegevens bij OD 550 nm (figuur 4A). De optische dichtheid en het droge gewicht concentratie gegevens kunnen worden gecorreleerd (figuur 4B). Dit wordt bereikt door de eerste berekening van de concentratie van de algen droge eindgewicht na de freeze-drying stap. Vervolgens kan de optische dichtheid van de cultuur seriële verdunning (uitgevoerd op de laatste dag v…

Discussion

De belangrijkste overweging bij het kweken van algen is een goed begrip van de specifieke behoeften van het organisme of groep van organismen. De algen Cultuurstelsel hier beschreven kan worden gebruikt om de cultuur van een breed scala van algen, maar de specifieke abiotische factoren (temperatuur, media, pH, licht intensiteit, CO₂ -niveau, beluchting tarief) moeten worden aangepast aan de behoeften van het organisme. Opmerking de hier beschreven parameters werden gebruikt voor de teelt van Chlorella…

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles	Corning	16157-191	For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp	Home Depot	UC953A	or equivalent
1/4" female luer to barb	Nordson biomedical	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-244	50'
1/4" in O-rings	Grainger	1REC5	#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb	Nordson biomedical	FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-608	250'
1/8" male spinning luer to barb	Nordson biomedical	MLRL013-6005
1/8" multiport barb	Nordson biomedical	4PLL230-6005	1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb	Nordson biomedical	18230-6005	1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer	Nordson biomedical	Nordson MLRLB230-6005	1/8", PP
10 gallon fish tank	Walmart	802262	Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter	Dwyer	RMA-13-SSV	For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank	Agrobrite	FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-14-SSV	For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles	Corning	16157-136	For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-12-SSV	For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter	Dwyer	RMA-151-SSV	For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm	Whatman/ Fisher	09-745-1A	Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves	VWR	89094-714
Corning lids for pyrex bottles	VWR	89000-233	10 GL45 lids
Female luer endcap	Nordson biomedical	Nordson FTLLP-6005	Female stable PP
Hybridization tubes	Corning	32645-030	35×300 mm, pack of 2
Light timer	Walmart	556393626
Locknuts	Nordson biomedical	Nordson LNS-3	1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer	VWR	10153-690	Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap	Nordson biomedical	Nordson LP4-6005	Male plug PP
Spinning luer lock ring	Nordson biomedical	Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long	VWR	58949-040	38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium	VWR	58949-034	25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters	VWR	28145-491	13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes	Air-tite	89215-216	For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes	VWR	87003-294	Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes	Greiner Bio-One	82050-482	Sterile (or equivalent)
100 mm plates	VWR	25384-342	100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-276	Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips	Greiner Bio-One	82051-584	Sterile (or equivalent)
2 mL tubes	VWR	87003-298	Sterile (or equivalent)
50 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-348	Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate	Greiner Bio-One	89089-578	Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops	VWR	80094-478	Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator	Airgas	CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes	VWR	10158-556	Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates	Greiner Bio-One	82050-774	Polypropylene, flat bottom
Bleach	Walmart	550646751	Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform	BDH	BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol	BDH	BDH1133-1LP
Methanol	BDH	BDH20864.400
Nile red	VWR	TCN0659-5G
Pasteur pipette tips	VWR	14673-010
Sodium chloride	BDH	BDH9286-500G
Vegetable oil	Walmart	9276383	Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)	Biospec products	11079105z
Equipment
Analytical balance	Mettler-Toledo	XS205DU	Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer	Omni	19-040E
Benchtop micro centrifuge	Thermo	Heraeus Fresco 21 with 24×2	Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater	VWR	75838-282	Including dry block for a microplate
Freeze dryer	Labconco	7670520	2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge	Thermo	Heraeus Megafuge 16R Tissue	Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer	VWR	10153-838