बुलबुला कॉलम Photobioreactors में ग्रीन सूक्ष्म शैवाल की खेती और तटस्थ लिपिड के लिए एक परख
Summary
यहाँ, हम प्रयोगशाला पैमाने बुलबुला स्तंभ photobioreactors का निर्माण और उन्हें संस्कृति सूक्ष्म शैवाल के लिए उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । यह भी संस्कृति विकास दर और तटस्थ लिपिड सामग्री के निर्धारण के लिए एक विधि प्रदान करता है ।
Abstract
ऐसे जैव ईंधन, उच्च मूल्य के उत्पादों के उत्पादन के रूप में इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए सूक्ष्म शैवाल के अध्ययन में महत्वपूर्ण रुचि है, और अपशिष्ट पदार्थों के उपचार के लिए । के रूप में सबसे नए अनुसंधान के प्रयास प्रयोगशाला पैमाने पर शुरू, वहां एक reproducible तरीके से संवर्धन सूक्ष्म शैवाल के लिए लागत प्रभावी तरीकों के लिए एक की जरूरत है । यहां, हम प्रयोगशाला में संस्कृति सूक्ष्म शैवाल के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण पैमाने photobioreactors संवाद, और उस शैवाल के विकास और तटस्थ लिपिड सामग्री को मापने के लिए । निर्देश भी photobioreactor प्रणाली स्थापित करने के लिए कैसे पर शामिल किए गए हैं । उदाहरण के जीवों Chlorella और Auxenochlorellaकी प्रजातियों रहे हैं, इस प्रणाली को गैर-शैवाल प्रजातियों के साथ शैवाल की सह संस्कृतियों सहित, सूक्ष्म शैवाल की एक विस्तृत श्रृंखला खेती करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । स्टॉक संस्कृतियों पहले बोतलों में हो रहे है photobioreactor प्रणाली के लिए इनोक्युलम का उत्पादन । शैवाल इनोक्युलम केंद्रित है और बैच मोड में खेती के लिए photobioreactors को हस्तांतरित । नमूने ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग के लिए दैनिक एकत्र कर रहे हैं । बैच संस्कृति के अंत में, कोशिकाओं को केंद्रापसारक द्वारा काटा जाता है, धोया, और स्थिर करने के लिए एक अंतिम शुष्क वजन एकाग्रता प्राप्त सूख । अंतिम शुष्क वजन एकाग्रता के लिए ऑप्टिकल घनत्व और शुष्क वजन एकाग्रता के बीच एक संबंध बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक संशोधित Folch विधि बाद में फ्रीज से कुल लिपिड निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है-सूखे बायोमास और निकालने अपने तटस्थ लिपिड एक microplate परख का उपयोग कर सामग्री के लिए परख है । इस परख पहले प्रकाशित किया गया है, लेकिन प्रोटोकॉल कदम यहां शामिल करने के लिए प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम जहां त्रुटियां अक्सर हो प्रकाश डाला गया । प्रतिक्रिया प्रणाली यहां वर्णित सरल कुप्पी खेती और पूरी तरह से नियंत्रित वाणिज्यिक विरोधी के बीच एक आला भरता है । यहां तक कि उपचार के प्रति केवल 3-4 जैविक प्रतिकृति के साथ, संवर्धन शैवाल के लिए हमारे दृष्टिकोण विकास और लिपिड परख में तंग मानक विचलन की ओर जाता है ।
Introduction
इंजीनियरिंग और जैव प्रौद्योगिकी में सूक्ष्म शैवाल के आवेदन हाल के वर्षों में बहुत रुचि को आकर्षित किया है । सूक्ष्म शैवाल अपशिष्ट जल उपचार में उपयोग के लिए अध्ययन किया जा रहा है1,2,3,4, जैव ईंधन उत्पादन5,6,7,8, और न्यूट्रास्यूटिकल्स और अंय उच्च मूल्य के उत्पादों के उत्पादन9,10। शैवाल भी आनुवंशिक रूप से एक विशिष्ट इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए अपनी फिटनेस में सुधार करने के प्रयास में अधिक से अधिक दरों पर संशोधित किया जा रहा है11,12। नतीजतन, नियंत्रित सेटिंग्स में औद्योगिक रूप से प्रासंगिक जीवों के साथ प्रयोग में बहुत रुचि है । इस विधि का उद्देश्य एक नियंत्रित प्रयोगशाला वातावरण में संस्कृति सूक्ष्म शैवाल के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण संवाद करने के लिए, और उस शैवाल के विकास और तटस्थ लिपिड सामग्री को मापने के लिए है । विकास दर में सुधार और सूक्ष्म शैवाल के तटस्थ लिपिड सामग्री13मनोरथ जैव ईंधन के व्यावसायीकरण की ओर दो प्रमुख अड़चनों के रूप में पहचान की गई है ।
दृष्टिकोण की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रायोगिक प्रयोजनों के लिए संस्कृति शैवाल के लिए इस्तेमाल किया गया है । सामांय में, इन तरीकों को बड़े पैमाने पर बाहरी खेती और छोटे पैमाने पर इनडोर खेती के बीच विभाजित किया जा सकता है । photobioreactors और खुले तालाबों में बाहरी खेती प्रक्रियाओं है कि पहले से ही प्रयोगशाला पैमाने पर सिद्ध किया गया है स्केलिंग के उद्देश्य से प्रयोग के लिए उपयुक्त है (जैसे, पैमाने पर परीक्षण के लिए एक नए उच्च-शैवाल के लिपिड तनाव के ऊपर)14। हालांकि, इनडोर छोटे पैमाने पर खेती के लिए उपयुक्त है जब विकासशील नए या बेहतर शैवाल उपभेदों या जैविक तंत्र को समझने के उद्देश्य से प्रयोग प्रदर्शन । इन उत्तरार्द्ध मामलों में, प्रयोगात्मक नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के लिए बाहर जैविक व्यवहार में सूक्ष्म परिवर्तन चिढ़ाने की आवश्यकता है । कि अंत करने के लिए, axenic संस्कृतियों अक्सर जटिल बायोटिक अंय जीवों (जैसे बैक्टीरिया, अंय शैवाल) है कि अनिवार्य रूप से बड़े पैमाने पर आउटडोर प्रणालियों में विकसित करने के साथ जुड़े कारकों को कम करने के लिए आवश्यक हैं । यहां तक कि जब शैवाल और अंय जीवों के बीच बातचीत का अध्ययन, हमने पाया है कि अत्यधिक नियंत्रित प्रयोगात्मक स्थितियों का उपयोग उपयोगी है जब जीवों के बीच आणविक विनिमय की जांच15,16,17।
छोटे पैमाने पर इनडोर शैवाल की खेती की श्रेणी के भीतर, दृष्टिकोण की एक सीमा का इस्तेमाल किया गया है । शायद सबसे आम दृष्टिकोण एक प्रकाश बैंक के नीचे एक शेखर मेज पर Erlenmeyer कुप्पी में शैवाल विकसित करने के लिए है18,19। ऑक्सीजन और2 सह के आदान प्रदान की कुप्पी के शीर्ष में एक फोम प्लग के माध्यम से निष्क्रिय प्रसार द्वारा जगह लेता है । कुछ शोधकर्ताओं ने इस सेट-अप की कुप्पी20के सक्रिय वातन के माध्यम से सुधार किया है । एक और दृष्टिकोण को बोतलों में शैवाल की खेती, बार और सक्रिय वातन हलचल द्वारा मिश्रित है । अपनी सादगी के बावजूद, हमने पाया है कि कुप्पी और बोतलों का उपयोग अक्सर जैविक प्रतिकृति के बीच असंगत परिणाम की ओर जाता है । संभवतः इस स्थिति के प्रभाव की वजह से है-विभिंन पदों प्रकाश, जो भी आंतरिक रिएक्टर तापमान को प्रभावित के विभिंन मात्रा में प्राप्त करते हैं । नए पदों के लिए रिएक्टरों के दैनिक रोटेशन में मदद कर सकते हैं, लेकिन इस समस्या को कम नहीं है क्योंकि शैवाल विकास के कुछ चरणों (जैसे, जल्दी घातीय) दूसरों की तुलना में स्थिति प्रभाव के लिए और अधिक संवेदनशील होते हैं (उदा., लॉग चरण) ।
तकनीकी परिष्कार के स्पेक्ट्रम के विपरीत पक्ष पर पूरी तरह से नियंत्रित वाणिज्यिक photobioreactors हैं । इन प्रणालियों लगातार निगरानी और रिएक्टर में शर्तों को समायोजित करने के लिए शैवाल विकास का अनुकूलन । वे प्रोग्राम प्रकाश व्यवस्था, वास्तविक समय तापमान नियंत्रण, और पीएच नियंत्रण है । दुर्भाग्य से, वे महंगे है और आम तौर पर रिएक्टर प्रति कई हजार डॉलर की लागत । अधिकांश वैज्ञानिक और इंजीनियरिंग पत्रिकाओं में परिणामों की जैविक प्रतिकृति की आवश्यकता होती है, अनेक necessitating की खरीद की जाती है । हम यहां एक बुलबुला कॉलम रिएक्टर प्रणाली है कि पुल सरल (कुप्पी) और परिष्कृत (पूरी तरह से नियंत्रित-प्रतिक्रिया) प्रयोगशाला पैमाने पर शैवाल की खेती के लिए दृष्टिकोण के बीच विभाजित । बुलबुला स्तंभों गैस विनिमय की सुविधा के लिए बढ़ती गैस बुलबुले का उपयोग करें और रिएक्टर मिश्रण । इस दृष्टिकोण प्रकाश और तापमान पर नियंत्रण के कुछ डिग्री प्रदान करता है, लेकिन एक तरीका है कि लागत प्रभावी है में ऐसा करता है । इसके अलावा, हम इस प्रणाली के लिए जैविक प्रतिकृति के बीच अत्यधिक सुसंगत परिणाम उपज पाया है, जैविक की आवश्यकता की संख्या को कम करने के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए जब कुप्पी या बोतल दृष्टिकोण की तुलना में आवश्यक प्रतिकृतियां । हम भी सफलतापूर्वक शैवाल और बैक्टीरिया21के मिश्रण की खेती के लिए इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है । शैवाल की खेती के अलावा, हम संस्कृतिपूर्ण शैवाल में तटस्थ लिपिड सामग्री को मापने के लिए एक प्रक्रिया रूपरेखा । बाद विधि22कहीं प्रकाशित किया गया है, लेकिन हम प्रक्रिया यहां शामिल करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करने के लिए कैसे इसे सफलतापूर्वक रोजगार के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे महत्वपूर्ण विचार जब संवर्धन शैवाल जीव या जीवों के समूह की विशिष्ट आवश्यकताओं की समझ है । शैवाल खेती प्रणाली यहां वर्णित शैवाल की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध के लिए समर्थन USDA राष्ट्रीय खाद्य और कृषि हैच परियोजना ALA0HIGGINS और Auburn विश्वविद्यालय प्रोवोस्ट के कार्यालयों, अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष, और शमूएल Ginn कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग द्वारा प्रदान की गई थी । NSF ग्रांट CBET-१४३८२११ द्वारा भी सहायता प्रदान की गई ।
Materials
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
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