Kabarcık sütun Photobioreactors ve bir tahlil yeşil mikroalg ekimi için nötr lipitler
Summary
Burada, laboratuvar ölçekli kabarcık sütun photobioreactors oluşturmak ve onları kültür mikroalg için kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca kültür büyüme oranı ve tarafsız lipid içeriğin belirlenmesi için bir yöntem sağlar.
Abstract
Mikroalg üretim Biyoyakıt, yüksek değerli ürünler, gibi mühendislik uygulamaları için ve atıkları tedavisi için çalışmanın önemli ilgi vardır. En yeni araştırma çabalarının laboratuvar ölçekte başladığınızda, tekrarlanabilir bir şekilde mikroalg kültür için uygun maliyetli yöntemler için bir ihtiyaç vardır. Burada, biz kültür mikroalg laboratuvar ölçekli photobioreactors ve büyüme ve tarafsız lipid içeriğin bu alg ölçmek için etkili bir yaklaşım iletişim. Yönergeler de photobioreactor sistemi kurmak nasıl yer almaktadır. Örnek organizmalar Chlorella ve Auxenochlorellatür olmakla birlikte, bu sistem mikroalg yosun sigara-alg türleri ile ortak kültürleri de dahil olmak üzere, çok çeşitli yetiştirmek için adapte edilebilir. Hisse senedi kültürler ilk inoculum photobioreactor sistemi için üretmek şişelerde yetiştirilmektedir. Yosun inoculum konsantre ve photobioreactors ekimi toplu modunda aktarılır. Örnekleri her gün optik yoğunluk okumaları için toplanır. Toplu iş kültür sonunda hücreleri tarafından yıkanmış, santrifüj, hasat ve son Kuru ağırlık konsantrasyonu elde etmek için kuru dondurma. Son Kuru ağırlık konsantrasyon optik yoğunluk ve Kuru ağırlık konsantrasyonu arasında bir ilişki oluşturmak için kullanılır. Değiştirilmiş Folch yöntemi daha sonra toplam lipidler dondurularak biyokütle ayıklamak için kullanılır ve özü Mikroplaka tahlil kullanarak tarafsız lipid içeriğini denetlesinler. Bu tahlil daha önce yayımlandı, ancak protokol adımları burada kritik hataları sık sık oluştuğu yordamın adımlarını vurgulamak için dahil edildi. Burada açıklanan biyoreaktör sistemi basit şişesi yetiştirme ve ticari Biyoreaktörler tam kontrollü arasında bir niş doldurur. Hatta sadece 3-4 biyolojik ile tedavi çoğaltır, yosun kültür bizim yaklaşım büyüme ve lipid deneyleri sıkı standart sapmaları yol açar.
Introduction
Mikroalg Mühendisliği ve Biyoteknoloji Uygulama son yıllarda büyük ilgi çekti. Mikroalg okudu kullanılmak üzere Atıksu Arıtma1,2,3,4, biyoyakıt üretimi5,6,7,8ve üretim nutraceuticals ve diğer değeri yüksek ürünler9,10. Yosun da genetik olarak daha büyük oranlarda bir çaba onların zindelik belirli mühendislik uygulamaları11,12geliştirmek için değiştirilen. Sonuç olarak, deneme büyük ilgi ile endüstriyel ilgili kontrollü ayarları organizmalarda vardır. Bu yöntemin amacı kültür mikroalg kontrollü laboratuvar ortamında etkili bir yaklaşım iletişim kurmak ve büyüme ve tarafsız lipid içeriğin bu alg ölçmek için var. Büyüme artırma oranları ve tarafsız lipid mikroalg içeriğini iki anahtar performans sorunlarını ticarileştirilmesi alg biyoyakıt13doğru olarak belirlenmiştir.
Çok çeşitli yaklaşımlar kültür algler için Deneysel amaçlar için kullanıldığını. Genel olarak, bu yaklaşımları büyük ölçekli açık ekimi ve küçük ölçekli kapalı ekimi arasında bölünmüş olabilir. Photobioreactors ve açık havuzlar açık ekimi için deneme amaçlı laboratuvar ölçekte (ölçek-up yeni yüksek-lipid zorlanma alg sınamak içinÖrneğin, ) zaten kanıtlanmış süreçleri kadar ölçekleme uygun14. Ancak, kapalı küçük ölçekli ekimi yeni veya geliştirilmiş yosun suşları geliştirilirken uygundur veya biyolojik mekanizmaları anlama deneyler yapmak amaçlı. Bu ikinci durumda, deneysel kontrol derecesini yüksek biyolojik davranışı ince değişiklikleri dışarı alay için gereklidir. Bu amaçla, axenic kültürlerin kez kaçınılmaz olarak büyük ölçekli açık sistemlerinde büyümeye diğer organizmalar (Örneğin bakteri, diğer algler) ile ilişkili karmaşık biyotik faktörler en aza indirmek için gereklidir. Alg ve diğer organizmalar arasındaki etkileşimler bile okurken, biz son derece kontrollü deneysel koşullar kullanımı organizmalar15,16,17arasında moleküler değişimi incelerken yararlı bulduk.
Küçük ölçekli kapalı yosun ekimi kategori içinde yaklaşımlar bir dizi kullanılmıştır. Belki de en yaygın bir shaker tablo altında bir ışık banka18,19Erlenmeyer şişeler içinde yosun büyümeye yaklaşımdır. Oksijen ve CO2 Exchange tarafından pasif difüzyon balonun üstündeki bir köpük fiş aracılığıyla gerçekleşir. Bazı araştırmacılar bu kurulum şişeler20etkin havalandırma yoluyla iyileştirilmiştir. Yosun heyecan bar ve etkin havalandırma tarafından karışık şişelerde yetiştirmek için başka bir yaklaşımdır. Onların basitliğine rağmen bulduk şişe ve şişe kez biyolojik çoğaltır arasında tutarsız sonuçlara yol açar. Muhtemelen bu pozisyon etkileri nedeniyle – farklı pozisyonlarda da iç Reaktör sıcaklığı etkiler ışık, farklı miktarda almak. Günlük rotasyon reaktörler yeni pozisyonlar için yardımcı olabilir ama sorun çünkü hafifletmek değil yosun büyümesini belirli aşamalarında (Örneğin, erken üstel) pozisyonel etkileri (Örneğin, log fazı) diğerlerine göre daha hassas.
Teknolojik gelişmişliği spektrum karşı tarafta tam kontrollü ticari photobioreactors vardır. Bu sistemler sürekli olarak izlemek ve yosun büyümesini optimize etmek için reaktör koşullarda ayarlayın. Programlanabilir aydınlatma, gerçek zamanlı sıcaklık kontrolü ve pH kontrolü ellerinde. Ne yazık ki, onlar pahalı ve genellikle reaktör birkaç bin dolarlık mal. En bilimsel ve mühendislik günlükleri sonuçlarının birden çok Biyoreaktörler satın gerektiren biyolojik çoğaltma gerektirir. Burada basit (balon) ve sofistike (biyoreaktör) tam kontrollü arasındaki laboratuvar ölçekli yosun ekimi için yaklaşımlar bu köprü bir kabarcık sütun reaktör sistem mevcut. Kabarcık sütunları gaz kabarcıkları gaz alışverişini kolaylaştırmak ve reaktör karışımı kullanın. Bu yaklaşım bazı ışık ve sıcaklık kontrol sağlayan ama çok maliyet-etkili bir şekilde yapar. Ayrıca, biz biyolojik çoğaltır şişesi veya şişe yaklaşım karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için gerekli olan gerekli sayısını azaltarak biyolojik çoğaltır arasında son derece tutarlı sonuçlar için bu sistemi bulduk. Bu sistem de başarıyla karışımları yosun ve bakteri21yetiştirmek için kullandık. Yosun ekimi yanı sıra, kültürlü yosun tarafsız lipid içeriğindeki ölçmek için bir yordam anahat. İkinci yöntem olmuştur, ama başka bir yerde22yayınlanan nasıl başarılı bir şekilde istihdam konusunda adım adım yönergeler sağlamak için yordam eklemeniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yosun kültür zaman en önemli faktör bir organizma veya grup organizmalar özel ihtiyaçlarını anlaşılmasıdır. Yetiştirme sistemi burada anlatılan yosunlar ama belirli abiyotik faktörler (sıcaklık, medya, pH, ışık şiddeti, CO2 düzeyi, havalandırma oranı) geniş bir kültür için kullanılabilir yosun organizma ihtiyaçlarına ayarlanması gerekir. Not burada açıklanan parametreleri tarım Chlorella ve Auxenochlorellaiçin kullanıldı. Yüksek besin, ışık ve sıcakl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma için destek USDA Ulusal Enstitüsü Gıda ve tarım ambarı projesi ALA0HIGGINS ve Provost, ahlak bozukluğu başkan için araştırma ve Samuel Ginn kolej mühendislik Auburn Üniversitesi ofisleri tarafından sağlandı. Destek de NSF tarafından sağlanan CBET 1438211 verin.
Materials
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
- Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
- Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
- Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
- Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
- Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
- Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
- Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae–A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
- Branyikova, I., et al. Microalgae – Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
- Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
- Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
- Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
- Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
- Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
- Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
- Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
- Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
- Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
- Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
- Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
- Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
- Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
- Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
- Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochemistry. , 578-730 (2012).
- de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -. P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
- Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. . Annual International Meeting of the ASABE. , (2018).
