Fristående blad analyser för att förenkla gen uttrycks studier i potatis under angrepp genom att tugga insekt Manduca Sexta
Summary
Den presenterade metoden skapar naturliga växtätare skadade växtvävnad genom tillämpning av Manduca Sexta larver till fristående blad av potatis. Växt vävnaden är analyseras för uttryck av sex transkriptionsfaktor homologs inblandade i tidiga svar på insekt herbivory.
Abstract
Den multitrofiska karaktären av gen uttrycks studier av insektsherbivory kräver ett stort antal biologiska replikat, vilket skapar behovet av enklare, mer strömlinjeformade herbivory-protokoll. Perturbations av tugg insekter studeras vanligtvis i hela växt system. Även om hela denna organism strategi är populär, är det inte nödvändigt om liknande observationer kan replikeras i ett enda fristående blad. Antagandet är att grundläggande element som krävs för signaltransduktion är närvarande inom själva bladet. När det gäller tidiga händelser i signaltransduktion behöver celler bara ta emot signalen från den störning och överföra signalen till angränsande celler som analyseras för genuttryck.
Den föreslagna metoden ändrar helt enkelt tidpunkten för avlossning. I hela växt experiment är larverna begränsade till ett enda blad som så småningom lossnar från växten och analyseras för genuttryck. Om beställa av excision vändas om, från Jumbo i hela växt studier, till först i den fristående studien, det utfodra experiment förenklas.
Solanum tuberosum var. Kennebec sprids genom nodal överföring i en enkel vävnad kultur medium och överföras till jord för ytterligare tillväxt om så önskas. Bladen är censurerade från moderplantan och flyttas till petriskålar där utfodringsanalysen utförs med larv stadierna av M. Sexta. Skadad bladvävnad analyseras för att uttrycka relativt tidiga händelser i signaltransduktion. Gen uttrycks analys identifierade infestation-specifika Cys2-His2 (C2H2) transkriptionsfaktorer, vilket bekräftar framgången med att använda fristående blad i tidiga responsstudier. Metoden är lättare att utföra än hela växt infestationer och använder mindre utrymme.
Introduction
Herbivory sätter i rörelse en rad molekylära händelser under vilka en anläggning kan både identifiera attacken och montera ett lämpligt svar för sin överlevnad. En planta får två grundläggande ledtrådar från tugg insekter; en från den fysiska skadan på vävnaden och den andra från insektsspecifika ämnen. Skade-associerade molekylära mönster (damps) släpps som svar på skador som skapats av larv mouthparts och utlösa ett väldefinierat sår svar som resulterar i en ökning av hormonet bildar syra och transkription av försvarsgener1. En av de mest kända damps är Systemin, en polypeptid som bildas av klyvning av den större prosystemin protein efter ett löv såras2,3. Den bildar Acid sår svar är ytterligare moduleras av herbivor-associerade molekylära mönster (hamps), som kan härledas från Caterpillar saliv, Gut innehåll (regurgitant) och avföring (Frass)4. Insekter använder dessa ämnen för att antingen öka eller kringgå försvaret svar5. Transkriptionsfaktorerna vidarebefordrar sedan budskapet från hormon signaler i försvars reaktionen via reglering av nedströms försvarsgener6,7,8.
Vissa växt-insekt interaktionsstudier som används i laboratorie inställningar är av den simulerade typen, med ett mål att approximera den naturliga metoden för utfodring av insekten. Simulerad herbivory är vanligtvis åstadkommas genom att skapa konstgjorda skador på växt vävnader med olika verktyg som efterliknar den specifika mekanismen för insekt mouthparts tillräckligt för att orsaka frisättning av DAMPs och utlösa produktionen av försvarsgener. Andra insektsspecifika komponenter såsom muntliga sekret eller uppstötningar tillsätts ofta för att replikera bidraget från hamps9,10,11. Skapandet av en specifik storlek och typ av sår och tillämpningen av exakta mängder HAMPs är en fördel för dessa typer av studier och kan erbjuda mer reproducerbara resultat. Naturliga herbivory studier, där skador på växtvävnad åstadkoms genom tillämpning av fält förvärvade eller laboratorie-uppfödda insekter, är ofta mer utmanande eftersom sår-storlek och HAMP belopp styrs av insekt beteende och lägga variation i Data. De naturliga kontra simulerade metoderna och deras för-och nackdelar är väl debatterade i litteraturen12,13,14.
För att studera tidiga signalering händelser såsom transkriptionsfaktorer, en viss procent av bladet måste konsumeras i en relativt kort tid, så larver måste börja tugga omedelbart och bibehålla konsumtionen tills bladet är fryst för analys. M. Sexta är en glupsk matare på flera familjen Solanaceae växter under många av sina larvstadier, vilket gör den idealisk för att förmedla maximal skada i en relativt kort tid15. Detta är praktiskt när man studerar tidiga signalering händelser, som anläggningen svar sker nästan omedelbart efter en insekt kontakter blad ytan16,17. Den vanligen använda Clip Cage-metoden för inneslutning bevisar klumpig, eftersom flera burar skulle kräva kontinuerliga justeringar i hela experimentet för att möjliggöra avlägsnande eller tillsats av larver. Bladen måste också vara tillräckligt stora och tillräckligt starka för att stödja flera insekter som utfodrings på samma gång. Dessa typer av potatisväxter kräver en stor mängd utrymme för att observera utfodring. Larverna kommer ofta att flytta till undersidan av blad ytan som också gör utfodring observationer ganska svårt. Att använda hela växter för att utföra dessa experiment är klart omständligt.
Den aktuella studien använder fristående blad isolerade i petriskålar snarare än hela växter för att effektivisera och förenkla hela anläggningen strategi för att studera herbivory. Tillämpningen av protokollet i denna studie är begränsad till observation av en grupp av C2H2 transkriptionsfaktorer induceras tidigt i potatis blad efter växtätande skador av M. Sexta larver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av befintliga hela växtherbivory metoder är onödigt att uppnå målet med denna särskilda studie (dvs, skärm en uppsättning av kandidatgener för deras svar på angrepp). Den uppenbara fördelen med den fristående blad förfining är förkorta den tid det tar att utföra herbivory analyser. Den otympliga naturen hos hela växter med Clip burar elimineras och analyser utförs förr, eftersom växter så unga som 2 veckor kan användas för att skörda löv. Det kräver också en mycket mindre fotavtry…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Bob Farrar och Alexis Park för att ge insekter som används i denna studie och för deras expertis i larv iscensättning. Ytterligare tack till Michael Blackburn och Saikat Ghosh för kritisk granskning av manuskriptet.
Omnämnandet av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande av det amerikanska jordbruksdepartementet.
USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
- . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
- . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
- . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
