Summary
Sunulan yöntem, Manduca Sexta larvası uygulama aracılığıyla doğal otobur hasarlı bitki dokusu oluşturur patates ayrılmış yaprakları. Bitki dokusu böcek herbivory erken tepkiler dahil altı transkripsiyon faktör homolog ifadesi için farklı teknik kullanılarak.
Abstract
Böcek otoburluğu gen ifade çalışmalarının multitrofik doğası biyolojik çoğaltır, daha basit, daha aerodinamik otoburluğu protokolleri için ihtiyaç yaratan çok sayıda gerektirir. Çiğneme böceklerin perturbations genellikle tüm bitki sistemlerinde incelenmiştir. Bu tüm organizma stratejisi popüler iken, benzer gözlemler tek bir müstakil yaprak çoğaltılabilir Eğer gerekli değildir. Varsayım, sinyal dönüştürücü için gerekli temel öğelerin yaprak kendisi içinde mevcut olmasıdır. Sinyal dönüştürücünde erken olaylar durumunda, hücrelerin sadece pertürasyon sinyali almak ve bu sinyal gen ifadesi için farklı teknik kullanılarak komşu hücrelere iletmek gerekir.
Önerilen yöntem sadece dekolmanı zamanlamasını değiştirir. Tüm bitki deneylerinde, larvalar sonunda bitkinden ayrılmış ve gen ifadesi için yapılan tek bir yaprak ile sınırlıdır. Eğer eksizyon sırası tersine, tüm bitki çalışmalarında son, Müstakil çalışmada ilk, besleme deneyi basitleştirilmiştir.
Solanum tüberozum var. Kennebec basit bir doku kültürü ortamında nodal transferi ile yayılır ve istenirse daha fazla büyüme için toprağa aktarılır. Yaprakları ebeveyn bitkinden eksiz ve beslenme tahlil M. Sextalarva aşamaları ile yürütülen Petri yemekleri taşındı. Hasar görmüş yaprak dokusu, sinyal dönüştürücünde nispeten erken olayların ifadesinde görülmektedir. Gen ifadesi analizi, erken tepki çalışmalarında müstakil yaprakları kullanmanın başarısını teyit eden, istila-spesifik Cys2-His2 (C2H2) transkripsiyon faktörlerini belirledi. Yöntem tüm bitki istilaları daha gerçekleştirmek için daha kolay ve daha az yer kullanır.
Introduction
Herbivory, bir bitkinin hem saldırıyı tanımlayacağı hem de hayatta kalabilmesi için uygun bir tepkiye sahip olduğu bir dizi moleküler olayı hareket halinde ayarlar. Bir bitki çiğneme böceklerden iki temel ipuçları alır; doku ve diğer böcek spesifik maddelerden fiziksel hasar biri. Hasar ile ilişkili moleküler desenler (damps) larva ağızlı tarafından oluşturulan hasarlara yanıt olarak serbest bırakılır ve iyi tanımlanmış bir yara yanıtı tetiklemek, hormon jasmonik asit ve savunma genler transkripsiyon bir artış sonuçları1. En iyi bilinen damps biri systemin, bir yaprak yaralandıktan sonra büyük prosystemin protein bölünme tarafından oluşturulan bir polipeptid olduğunu2,3. Jasmonik asit yara tepkisi, Caterpillar tükürük, gut içeriği (regurgitant) ve dışkı (Frass)4elde edilebilir herbivore ilişkili moleküler desenler (hamps), daha da modüle edilir. Böcekler, savunma tepkisi5' i artırmak veya kaçınmak için bu maddeleri kullanır. Transkripsiyon faktörleri daha sonra akış savunma genler düzenlenmesi ile savunma tepkisi hormon sinyalleri gelen mesaj röle6,7,8.
Laboratuar ayarlarında kullanılan bazı bitki böcek etkileşimi çalışmaları, böcek tarafından beslenme doğal yöntemi yaklaşarak bir amacı ile simüle türü vardır. Simüle otoburluğu genellikle damps serbest bırakılması neden ve savunma genler üretimini tetiklemek için yeterli böcek ağlarının belirli mekanizmasını taklit çeşitli araçlar ile bitki dokularına yapay hasar oluşturarak gerçekleştirilir. Oral salgıları veya Regürjitasyonlu gibi diğer böcek özgü bileşenleri genellikle9,10,11hamps katkı çoğaltmak için eklenir. Belirli bir boyut ve yara türü oluşturulması ve HAMPs kesin miktarlarda uygulama bu tür çalışmalar için bir avantajdır ve daha tekrarlanabilir sonuçlar sunabilir. Bitki dokusuna zarar alan elde edilen veya laboratuar-reared böcekler uygulaması ile gerçekleştirildiği doğal otoburluğu çalışmalar, genellikle daha zor çünkü yara boyutu ve Hamp tutarlar böcek davranışına göre yönetilir ve değişkenlik eklemek Veri. Doğal VERSUS simülasyonu yöntemleri ve avantajları ve dezavantajları literatürde tartışılır12,13,14.
Transkripsiyon faktörleri gibi erken sinyalizasyon olaylarını incelemek için, yaprak belirli bir yüzdesi nispeten kısa bir süre içinde tüketilen olmalıdır, bu yüzden larva hemen çiğnemek ve yaprak analiz için dondurulmuş kadar tüketimini sürdürmek gerekir. M. Sexta , larva aşamalarının birçoğu sırasında birden fazla solanaceous bitkide bulunan, nispeten kısa bir süre içinde maksimum hasar vermek için ideal olan15. Bu, erken sinyal olaylarını okurken, bitki tepkisi hemen hemen bir böcek yaprak yüzeyi16,17iletişim sonra oluştuğu için uygundur. Birden fazla kafes larvaların kaldırılması veya eklenmesi için izin vermek için deney boyunca sürekli ayarlamalar gerektirecektir gibi koruma yaygın kullanılan klip kafes yöntemi, sakar kanıtlıyor. Yaprakları da yeterince büyük ve aynı zamanda birden fazla böcek besleme desteklemek için yeterince güçlü olmalıdır. Bu tür patates bitkileri beslenme gözlemlemek için alan büyük miktarda gerektirir. Larva genellikle aynı zamanda besleme gözlemlerini oldukça zor kılan yaprak yüzeyinin alt tarafına taşınacaktır. Bu deneyler yapmak için tüm bitkiler kullanarak açıkça hantal olduğunu.
Mevcut çalışmada, herbivory eğitimi için tüm bitki yaklaşımı kolaylaştırmak ve kolaylaştırmak için tüm bitkiler yerine Petri yemeklerinde izole müstakil yaprakları kullanır. Bu çalışmada protokolün uygulanması, M. Sexta larvaları tarafından herbivoröz hasarlardan sonra patates yaprakları erken Indüklenen C2H2 transkripsiyon faktörlerinin bir grup gözlem sınırlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: aşağıdaki protokol, bir kişi ayarlamak, gözlem yapmak ve örnekleri toplamak için tasarlanmıştır. Aynı kurulum birden fazla çalışır biyolojik çoğaltma artırmak için birleştirilebilir. Deney her ek tekrarlar gen ifadesi olası gündüz etkilerini ortadan kaldırmak için günün aynı zamanda ayarlanması gerekir. Protokol 5 ayrı hasat zaman noktaları için 3 ' istila ' yaprakları oluşturmak için tasarlanmıştır. Her zaman noktası için eşleşen denetim yaprakları toplam 30 örnek oluşturun. Deney çeşitli yaprak boyutları ve larva aşamaları ile yapılabilir, ancak yaprak boyutu, larva aşaması ve istila süresi prosedür boyunca tutarlı olması önerilir.
1. patates bitkilerin hazırlanması
Not: steril teknik gerektiren tüm adımlar bir doku kültürü kaputu18,19yapılmalıdır.
- Kennebec fidanları 'i eksplant kaynağından hazırlayın.
- Yayma ortamını hazırlayın.
- Eklemek 4,43 g Murashige ve Skoog (MS) vitamin tozu ile, 20 g sakaroz ve 2 g agar yerine 1 l reverse osmoz (ro)-arıtılmış su bir spin Bar ile 2 l Flask. Bir karışım plaka ve mix transfer Flask. Karıştırma devam ederken NaOH kullanarak 5,8 için pH ayarlayın.
Not: agar otoklav kadar çözülür olmaz. - 20 dakika (121 °C, 101,3 kPa) için sıvı döngüsünde 1 mL Preservative/biyosit ve otoklav ekleyin. Döngü bittikten hemen sonra otoklav orta çıkarın ve 50 °C ' ye soğutur. 100 mL steril ve soğutmalı yayılma ortamını steril kültür gemilerine (örn. Magenta veya Plantcon) doku kültürü kaputu içinde steril tekniği kullanarak aktarın.
- Eklemek 4,43 g Murashige ve Skoog (MS) vitamin tozu ile, 20 g sakaroz ve 2 g agar yerine 1 l reverse osmoz (ro)-arıtılmış su bir spin Bar ile 2 l Flask. Bir karışım plaka ve mix transfer Flask. Karıştırma devam ederken NaOH kullanarak 5,8 için pH ayarlayın.
- Eksplant malzemesi hazırlayın.
- Kennebec tohum patates olarak eksplant kaynağı alın ve musluk H2O ile yıkayarak toprağın tüm izlerini kaldırmak. lahanası çıkarın ve steril bir neşter ile 2 cm parçalara kesilir.
- 70% etanol içinde 15 s ıslatarak filiz parçaları sterilize, ardından 13 dakika içinde 1:1 çamaşır suyu (1 Part ro-su: 1 parça konsantre antiseptik/ticari sınıf çamaşır suyu). Steril H2O 5 kez durulayın.
- Steril tekniği kullanarak bir doku kültürü kaputu yayılma orta ile steril doku kültürü gemiler için eksplant malzeme aktarın. Gemiler bir bitki dokusu kültür odasına aktarın ve 2 \ u20123 hafta veya 24 °c ' de fidanları formuna kadar Grow, 16 h ışık (140 μmol · m-2· s-1)/8 h koyu fotoperiod.
- Yayma ortamını hazırlayın.
- Nodal yayılmalı doku kültürü patates bitkileri hazırlayın.
- Nodal transfer ortamını hazırlayın.
Not: Bu, aynı gün kullanılabilecek 10 doku kültürü gemisi yapacaktır ya da zamanın öncesinde yapılabilir ve nodal transferine kadar 4 °C ' de depolanabilir.- Eklemek 36,43 g besin agar Mix 1 L RO-arıtılmış su bir spin Bar ile 2 L Flask. Bir karışım plaka ve mix transfer Flask. Karıştırma devam ederken KOH kullanarak 5,8 için pH ayarlayın.
Not: agar otoklav kadar çözülür olmaz. - 20 dakika (121 °C, 101,3 kPa) için sıvı döngüsünde otoklav. Döngü bittikten hemen sonra otoklav orta çıkarın ve 50 °C ' ye soğutur. Transfer 100 mL sterilizasyon soğutmalı nodal transfer orta steril kültür gemileri için ( malzeme tablosunabakın) bir doku kültürü kaputu steril tekniği kullanarak.
- Eklemek 36,43 g besin agar Mix 1 L RO-arıtılmış su bir spin Bar ile 2 L Flask. Bir karışım plaka ve mix transfer Flask. Karıştırma devam ederken KOH kullanarak 5,8 için pH ayarlayın.
- Nodal kesimleri hazırlayın.
- Elde Kennebec fidanları (adım 1.1.2 üretilen) eksplant malzeme büyüdü. Plantlets en az 3 ila 4 düğüm (Şube noktaları) olmalıdır. Steril makas veya neşter kullanarak yaprakları çıkarın. Şube dokusu yaklaşık 2 mm bırakarak, ana kök yakın dalları kes.
- Her şube noktasının veya düğümünün yaklaşık 2 mm üstündeki ve altındaki keserek nodal bölümlerini kökten çıkarın. Bir önceki gemi (Şube yukarı işaret) olarak aynı yönde nodal transfer Orta (adım 1.2.1.2 üretilen) içeren steril bir doku kültürü gemisinde nodal kesimler düzenleyin.
- Bir bitki dokusu kültür odasına nodal kesimler ile gemiler transfer ve Grow 2 \ u20123 hafta 24 °C, 16 h ışık (140 μmol · m-2· s-1)/8 h Dark photoperiod.
Not: her nodal kesme yeni bir plantlet içine büyüyecek. Her gemisinde kesim sayısı yaprak boyutunu belirler. Gemi başına aktarılan daha az kesim daha büyük yapraklara yol açacaktır. Gemi başına üç bitki 2 \ u20123 hafta içinde 15 mm x 20 mm yaprakları olacaktır.
- Nodal transfer ortamını hazırlayın.
- Isteğe bağlı Toprak yetiştirilmiş Kennebec patates bitkileri hazırlayın.
Not: daha büyük yaprakları üretmek için, nodal yayılmalı patates fidanları topraklara transfer edilebilir.- Transfer patates fidanları nodal transfer orta topraktan yavaşça tüm kök doku agar serbest bırakılıncaya kadar bitki orta çekerek yetiştirilen.
- Kökleri 1 düğümünün hemen üstünde toprağa transfer ve hafifçe nakli etrafında toprak paketi. Kök sistemi ile toprak teması sağlamak için yavaşça su.
- 16 h ışık (140 μmol · m-2· s-1)/8 h koyu fotoperiod ve 25/20 °c gündüz/gece sıcaklıklarına sahip bir büyüme odasına yerleştirin.
Not: bitkiler hazır olduğunda üst iki tam genişletilmiş yaprakları tahlil için uygun boyutuna ulaştı.
- Isteğe bağlı Yumru yetiştirilen patates bitkileri hazırlayın.
Not: tüstler tarafından yetiştirilen patates bitkileri daha büyük ve daha sağlam ve bitkilerde larva yetiştirme veya gece larva besleme istenirse yararlı olabilir.- 10 mL pelleted yavaş serbest gübre ile tamamlayıcı toprak karışımı içeren bir 10 derin bir patates yumru 6 yerleştirin.
- 16 h ışık (140 μmol · m-2· s-1)/8 h koyu fotoperiod ve 25/20 °c gündüz/gece sıcaklığına sahip bir büyüme odasına yerleştirin. Bitkiler yumru Ekim yaklaşık 30 \ u201240 gün hazır.
Not: çiçek başladı bitkiler kullanmayın.
2. beslenme için böceklerin hazırlanması
- M. Sextaistenilen larva aşaması elde.
Not: Bu çalışma için larva 5 INSTAR20 ile yapay diyet üzerinde yetiştirilen ve in-House mezbaha deneyimli bir birey tarafından sahnelendi. Larva da kısmen veya tamamen bitki dokusu üzerinde yetiştirilen olabilir. Larva hemen bir tüy dökme önce yemeyin ve en doğru tüy dökme sonra yemek muhtemeldir, bu yüzden uygun evreleme önemlidir21. - Larva boyutuna bağlı olarak, larvaları uygun bir koruma gemisine (örn. 6, 12, 24-iyi doku kültürü yemeği) aktarın. Yemeğinde iyi başına bir larva olmalı.
Not: larva bir gıda kaynağı olmadan toprak veya yamyam davranışı görüntüleyebilir ve birlikte barındırırsanız yaralanabilir. - Isteğe bağlı Bu larva beslenme artırabilir gibi 2 h kadar larva açlıktan.
Not: larva bu süre zarfında büyüme odasında saklanan bir muhafaza gemisinde olmalıdır.
3. istila deneyi için bileşenler kurulumu
Not: Şekil 1' de şematik özetine bakın.
- Her hasat zaman noktası için yerleştirme şablonları yapın.
Not: her hasat zaman noktası için 5 farklı tepsi kurmak yararlıdır. Bu örnekleri organize tutar ve yemekler daha verimli bir dizi olarak düzenlenmesi değiştirmeden taşınmasını sağlar. Hasar yüzdesi hesaplamaları gerçekleştirilecektir, bu önce-ve sonra-infestation görüntüleri aynı odak uzunluğuna yakalanmalıdır gibi esastır.- Altı uygun boyutta Petri tabağı ve beyaz kağıt ile hat tutan 5 sağlam tepsi edinin.
Not: Petri tabak boyutu besleme tahlil için seçilen yaprak boyutuna dayanmaktadır. Yaprak yan dokunmadan çanak kolayca sığmalıdır. Örneğin, 60 mm x 15 mm 'lik tabak, 50 mm 'ye kadar olan yapraklar için uygundur. - Her tepsisindeki kağıda uygun boyutta Petri tabağı kullanarak altı daire kümesini izleyin. Bir daire ' kontrol ' A, B ve C ve diğer ' istila ' A, B ve C etiketi bir dizi Ayrıca her yerleştirme şablonunu uygun hasat süresi ile etiketleyin.
- Altı uygun boyutta Petri tabağı ve beyaz kağıt ile hat tutan 5 sağlam tepsi edinin.
- Isteğe bağlı ' İstila öncesi ' ve ' istila sonrası ' görüntü yakalama için bir kamera ayarlayın.
- Yerleştirme şablonundaki tüm Petri yemeklerinden görüntü yakalama için uygun odak uzaklığında bir kamerayı stand üzerinde koruyun.
- Hasat zaman noktası tüplerini etiketleyin.
- Yerleştirme şablonundaki her daireye karşılık gelen 30, 1,7 mL mikrosantrifüjü tüpler kümesini etiketleyin. Tüpler uygun pertürbasyon (kontrol/istila), bitki çoğaltma harfi (A, B veya C) ve hasat zaman noktası (dakika sonrası istila dönemi sayısı) tanımlamak için etiket.
- 3.1.1 adımda seçilmiş Petri yemekleri hazırlayın.
- Adım 3.1.1 ' dan 30 Petri yemeklerinden her birinde steril bir filtre kağıt diski yerleştirin. Diskleri nemlendiren steril su ekleyin; çanak havuz fazla su izin vermez. Her çanak her yerleştirme şablonunda altı daire her yerleştirin.
- Her yerleştirme şablonunun yanında üç patates bitkileri konumlandırın. Bitkiler aynı yaş ve göreli boyutu olduğundan emin olun.
4. istilası gerçekleştirme
Not: bir seferde bir hasat zaman noktası/yerleştirme şablonu ayarlanmıştır.
- Steril makas ile her bitkiden üst iki boyutlu eşleşen yaprakları çıkarın ve her bitki (A, B ve C) için istila Petri çanak ve kontrol Petri çanak bir yaprak yerleştirin. Bu süreci olabildiğince çabuk gerçekleştirin.
- Isteğe bağlı ' İstiladan önce ' görüntüsünü yakalamak için yerleştirme şablonunu kamera standında aktarın.
- Mümkün olduğunca çabuk Soft touch forseps kullanarak larvaları her bir bulaşan çanak için aktarın. İstenen ' istila ' zaman zamanlayıcıyı ayarlayın.
Not: larvaları yaprak dokusunu tüketen zaman dönemi ' istila zamanı ' dir. Bu, gerçek istila başlamadan önce birkaç test yaprakları/larva kullanarak ampirik olarak tespit edilebilir bir şeydir. Seçilmiş ' istila zamanı ' tüm istila yaprakları için tutarlı olmalıdır.
Not: larva yumuşak dokunuş forseps ile bakım ile ele alınması gerekir. 2 ile 4 INSTAR yavaşça kendi boynuz veya midsection tarafından kavrayarak olabilir. - Tüm larvaları yediğinden emin olmak için beslenmeye dikkat edin. Larvaları besleme davranışına göre eklenmesi/kaldırılması gerekir. Petri yemeklerinden mümkün olduğunca fazla kapaklar tutun.
Not: yaprak başına birden fazla larva kullanılabilir. - İstilası süresi sonunda yapraklardan larvaları çıkarın. Hasat süresi için Zamanlayıcıyı başlatın.
- Isteğe bağlı ' İstila sonrası ' görüntüsünü yakalamak için yerleştirme şablonunu kamera standında aktarın.
Not: yerleştirme şablonundaki altı yaprakları belirli hasat zamanında hasat edilir.
5. hasat yaprakları
- Her yaprak her hasat zaman noktasının sonunda karşılık gelen etiketli tüp aktarmak ve sıvı N2içine tüp bırakarak hemen dondurmak. Hasat edilen bitki dokusunu-80 °C ' de RNA izolasyonuna kadar saklayın.
- Her hasat zaman noktası için 4 \ u 20125.1 adımları yineleyin.
6. gen ifadesi analizi için yaprak dokusunu işleme
- Dondurulmuş yaprak dokusu bir mikropestle bir toz grind.
- Daha önce açıklandığı gibi toplam RNA ve gen ifadesi sürecini yalıtın22.
7. (opsiyonel) yaprak hasarını tahmin etme
- Görsel olarak yaprak hasarı yüzdesini tahmin edin veya önce ve sonra-istila görüntülerde yaprak alanını hesaplayın.
- Yazılım araçları ile ölçmek yaprak alanı (örneğin, Phenophyte)23.
- Yaprak alan ölçümlerinden, hasar yüzdesini hesaplamak
% hasar = [(yaprak alanı önce – yaprak alanı sonra)/Leaf Area Before] x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yaprak tüketimi protokol başarısını tanımlar. Sağlıklı, doğru aşamalı larvaları, yaprak yüzeyine yerleştirildikten hemen sonra beslenmeye başlamalıdır ve beslenme, istila süresi boyunca oldukça tutarlı bir şekilde devam etmelidir. Video 1, üst larva yerleştirme hemen sonra çiğnemek başlar ve beslenme sırasında tutarlı bir oran tutar. Bu, özellikle istila sonrası erken gen ifadesi olaylarını anlatması durumunda önemlidir. Alt larva herhangi bir yaprak malzeme tüketmek vermedi ve başarısız bir istila örneğidir.
Yaprak tüketimi sırasında görsel yaklaşımlar yeterli hasar üretiliyor emin olmak için izlenir. Tüketilen yaprak malzemesi miktarı, istila öncesi ve sonrası yaprakları görüntüleri kullanarak hasar yüzdesi olarak hesaplanabilir. Şekil 2 , farklı türde patates bitkileri üzerinde M. Sexta larvaların farklı gelişimsel aşamaları ile tüketim değişken oranlarını gösterir. Şekil 2a 'daki yapraklar 2 haftalık nodal-yayılmalı doku kültürü bitkilerinin dışına çıkarılmış. Bu figürdeki tüm yapraklar aynı büyüklükte olmakla beraber larvaların farklı aşamaları ile 5 dakika boyunca istilasına maruz bırakılıyorlardı. Şekil 2a: ı-IV, video 2, video 3, video 4ve video 5 farklı oranları göstermektedir Her larva aşaması için tüketim ve beslenme stilleri istila bir bölümünden. Bu, her yaprak ve larva aşama kombinasyonunu kullanarak ne kadar hasar mümkün olduğunu belirlemede yararlıdır ve eski larvanın cesur doğası gösterilmektedir. Onların Mandible 5 dk istila penceresinde hasar üretmek için yeterli geliştirilmiş değildir olarak 1 INSTAR larva kullanımı tavsiye edilmez. Doku-kültür yetiştirilen bitkilerin daha genç daha ihale yaprakları genellikle larvaları için daha lezzetli olduğunu dikkate almak önemlidir. Bu sonuçlara dayanarak, 4. Instar larva daha olgun, toprak yetiştirilen patates bitkileri yaprakları zarar değerlendirmek için seçildi. Toprak yetiştirilen bitkiler daha yakından bu alanda edinilen yaklaşık. Şekil 2B , toprak yetiştirilen patates bitkilerine ayrılmış yapraklar için 3 ve 4 ' üncü INSTAR larvaları uygulandığında hasar aralığını göstermektedir. İki haftalık eski nodal yayılmalı bitkiler topraklara nakledildi ve ek 3 hafta boyunca büyüdü. Toprak yetiştirilen bitkilerin hasarlı yaprakları üç gruba düştü; 15-20%, 20-30% ve% 30-40. Her grupta üç yaprak her Aralık için farklı hasar düzeylerini temsil etmek için gösterilir. Daha olgun toprak yetiştirilen bitkilerin yaprakları daha fazla larva uygulanan ve daha uzun bir istila zaman daha genç nodal yayılan bitkilerin yaprakları gözlenen hasar aynı seviyeye ulaşmak için gerekli. Bu sonuçlar, farklı bitki türlerinden başarılı otoburluğu 'den mümkün olan sonuçlar aralığını göstermektedir.
Başarılı otoburluğu tamamlandıktan ve yüzde hasar değerlendirildikten sonra, yaprak dokusu gen ifadesi için incelenir. Gen ifadesi sonuçları, istilayı yanıtında yer alan transkriptler için sağlam bir indüksiyon veya baskının gösterilmelidir. Şekil 3 , Müstakil yaprakları başarılı bir otoburluğu deney altı C2H2 transkripsiyon faktörleri gen ifade profillerini göstermektedir. C2H2 çinko parmak StZFP2 önceki tüm bitki çalışmaları patates M. Sexta otoburluğu tarafından indüklenen24. StZFP2 müstakil yaprak tahlil otoburluğu tarafından indüklenmiş olmasına rağmen, istila dekolmanı kendisi etkisi ile karşılaştırıldığında önemli değildi. Ancak, diğer iki StZFP2 homologs, StZFP5 ve StZFP7, önemli ölçüde 40 ve 80 min Post otoburluğu içinde ayrılmış kontrolleri karşılaştırıldığında indüklenen edildi. StLOX3 ve StMYC2 Marker genler hem yaralama ve otoburluğu tarafından indüklenen ve jasmonik asit düzenlenmiş savunma yollarının katılımı gösterir. Bu çalışmanın amacı, aday genlerin bir paneli arasında infestasyon-duyarlı transkripsiyon faktörlerini belirlemektir. M. Sexta otoburluğu 'ye duyarlı olan iki C2H2 çinko parmak transkripsiyon faktörlerinin tanımlanması, istilası için müstakil yaprakların kullanımını destekler.
Şekil 1: istila Protokolü Için akış çizelgesi. Protokolün istila bölümünün deneysel iş akışında yer alan adımların şematik gösterimi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: M. Sexta larvaları nedeniyle yaprak hasarı. (A) her larva aşamasında doku kültürüne yüzde hasar 5 dk. Roma rakamları ı-IV, sırasıyla her bir INSTAR yem yaprak resimde göstermek 2-5 videolar bakın. (B) 20 dk. üzerinde 4 INSTAR tarafından toprak yetiştirilen yaprakları hasar aralığı Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3: yaprakların gen ifadesi analizi. Gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) C2H2 çinko parmak transkripsiyon faktörlerinin gen ifadesi Analizi gösterilir. Ortalama transkript seviyesi, 2− δct Ile (δct = test gen-CT eksojen kontrol geni CT). Her zaman noktasında (kırmızı) eksiz kontrol yaprakları (mavi) ve eksiz enfekte yaprakları gösterilir. Her değer üç biyolojik çoğaltır ortalamasıdır. ΔCt değerlerinde üç yönlü ANOVA yürütülmüştür. Kontrol içinde önemli farklılıklar zaman içinde yaprakları büyük harflerle belirtilir. Zaman içinde infenli yaprakları önemli farklar küçük harf belirtilir. Aynı zaman noktasında kontrol ve infenit yaprakları arasındaki önemli farklar yıldız işareti (*) ile gösterilir. PR > F değerleri 0,0086 ile StZFP6 kontrol tedavisi dışında, 0,001 'den küçüktür. Hata çubukları standart sapma temsil eder. NCBı üyelik numaraları: StLOX3-X 96406.1, StZFP2-MK809525, StZFP4-CV 500970.1, StZFP6-DN 587601.1, StZFP7-DN 590005.1. Spud DB üyelik numaraları < http://Solanaceae.plantbiology.msu.edu > StMYC2-PGSC0003DMT400045204, StZFP3-PGSC0003DMT400040144, StZFP5-PGSC0003DMT400040141. Bu rakam22' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Video 1: larva besleme video klip. İkinci INSTAR M. Sexta larvaları besleme (üst) ve iki hafta eski doku kültürü yetiştirilen patates bitki bir yaprak üzerinde beslenme (alt) değil. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Video 2: Şekil 2a video klibi (ı) larva besleme. İkinci INSTAR M. Sexta larva iki hafta eski doku kültürü yetiştirilen patates bitki bir yaprak beslenme. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Video 3: Şekil 2a video klibi (II) larva besleme. Üçüncü INSTAR M. Sexta larva iki hafta eski doku kültürü yetiştirilen patates bitki bir yaprak beslenme. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Video 4: Şekil 2a video klibi (III) larva besleme. Dördüncü INSTAR M. Sexta larva iki hafta eski doku kültürü yetiştirilen patates bitki bir yaprak beslenme. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Video 5: Şekil 2a video klibi (IV) larva besleme. Beşinci INSTAR M. Sexta larva iki hafta eski doku kültürü yetiştirilen patates bitki bir yaprak beslenme. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut tüm bitki otoburluğu metodolojilerinin kullanımı bu özel çalışmanın hedefini elde etmek için gereksiz (yani, istilası için onların tepkisi için aday genler bir dizi ekran). Müstakil yaprak arıtma bariz yararı otoburluğu assays gerçekleştirmek için gereken süreyi kısaltmak olduğunu. Klip kafesleri ile tüm bitkilerin hantal doğası ortadan kaldırılmıştır ve iki hafta gibi genç bitkiler hasat yaprakları için kullanılabilir olduğundan, daha erken gerçekleştirilir. Ayrıca, beslenme ve daha az büyüme odası alanı sırasında çok daha küçük bir ayak izi gerektirir; Bu kaynaklar sınırlı olduğunda her ikisi de önemli.
Bu testin sınırlama, yani dekolmanı, savunma-gen ifadesi tespit edildiğinde karşılaştı. Dekolmanın kendisi bir yara tepkisine neden olur ve bu nedenle, temel savunma-Gen ifadesinin bazal seviyelerinde hangi etkiye sahip olduğunu değerlendirmek önemlidir. Bir çalışmada simüle herbivory içeren, iyi bilinen bir savunma gen proteaz inhibitörü II(Pın2) transkript seviyeleri beklenmedik "yaprak toplama sırasında neden wounding" nedeniyle büyük olasılıkla ayrılmış patates yaprakları kontrol yaprakları yüksek oldu 25. ancak, M. Sexta böcek Regürjitasyonlu uygulama büyük miktarda PIN2 gen ifadesi gelişmiş. Bu, dekolmanı istilası tepkisinin etkisini kızdırmak için kontrolleri kullanma ihtiyacını göstermektedir.
Zaman, alan ve kaynakların tasarrufu için genellikle ayrılmış yaprak kaynakları gerçekleştirilir. Buğday26,27ve böcek direnci soya28 ve nohut29' da mantar hastalıklara karşı direnç taraması için kullanılmıştır. Tahlil yaygın patates geç yıkım neden patojen çalışmada kabul edilir30,31. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, alan32geç yıkım direnci belirlenmesi tüm bitki deneyleri eşdeğer olduğunu müstakil yaprak deneyleri bulundu.
Scant kanıtı literatürde var, ancak, savunma-gen ifadesi için tahlil için müstakil yaprakları kullanımı için. Bir çalışmada, Müstakil Lima fasulye33örümcek mite istilası yanıt olarak altı savunma genleri profilli. Yaprakları da uçucu üretilen yakındaki uninfested yaprakları, savunma iyi bilinen bir strateji-bitkide gen ifadesi tarafından indüklenen savunma tepkiler34. Bilgimize, hiçbir çiğneme böcek otoburluğu çalışmalar bugüne kadar, gen ifadesi için tahlil için müstakil yaprakları kullanır.
Önceden tanımlanan istila duyarlı C2H2 çinko parmak, StZFP2 önemli ölçüde mevcut müstakil yaprak assay istila tarafından indüklenen değildi. Dışında tüm bitki belirgin fark dışında ayrılmış yaprakları, önceki çalışma, bitki dokusu gen ifadesi için hemen larva kaldırılması aşağıdaki değerlendirildiği istila sürekli bir tür kullanılan24. Bu, larva kaldırılması Yaprak hasat öncesinde bir dinlenme süresi takip edildiği mevcut çalışmada kullanılan istilası kesintisiz türünden farklıdır. Bu iyileşme döneminde StZFP2 seviyeleri hızlı bir şekilde azalır ve daha düşük bir StZFP2 indüksiyon düzeyine neden olabilir. Ayrıca, tüm bitki çalışmada gözlenen artırılmış indüksiyon katkıda bulunabilir diğer so-uzak tanımlanmamış sistemik sinyalizasyon bileşenleri olabilir. Başka bir olasılık StZFP2 transkriptler 20 dk hasat süresi önce numaraya olabilir olmasıdır. Ancak, StZFP5 ve StZFP7 transkriptleri etkileyici indüksiyon istila protokol ilgili bu tür yapmak açıktır. Mevcut yöntemin başka bir sınırlama, Mısır Rootworm gibi kök besleme larvaları kullanmak için yetersizlik olacaktır. Aynı zamanda kök yaprak sinyal gibi tüm bitki iletişimi35 veya sistemik yapraklar36,37 incelenmektedir sinyalizasyon olarak uygun olmayacaktır.
Bu protokolün başarısı, denemede kullanılan larva kalitesinin ve doğru evrelemesinde yoğun olarak değişir. Beceri ve M. Sexta davranış temel bilgi yetiştirme yararlı ama kritik değildir. Ancak, sağlıklı, uygun şekilde aşamalı larvaları elde etmek, beslenme başarısını doğrudan etkileyebilir. Larvalar,21' i beslemedikleri her larva tüy dökme 'in önündeki bir sessizlik dönemine girer. Açıkçası, bu tür larvaları yaprak dokusuna zarar vermez. Larvaları kullanmak için ideal zaman sadece bir Molt sonra. Belirli bir larva aşamasından gelen böceklerden oluşan gelişimsel olarak düzenlenmiş bir kohort, bitkiler her gelişme aşamasına farklı yanıt verebilecek şekilde Gen ifadesinin yeniden üretilebilirliği de artıracaktır.
Bir insectary erişim larvaları temini için ideal olacaktır. M. Sexta yumurta veya larva da ticari kaynaklardan38,39 sipariş edilebilir ve uygun aşamaya diyet veya bitki malzemesi üzerinde yetiştirilen. Her INSTAR40,41,42tanımlamanıza yardımcı olabilecek çeşitli çevrimiçi araçlar da vardır. Larvalar diyet üzerinde yetiştirilen, bitkiler43üzerinde yetiştirilen larva tarafından elde edilen mikrobiyal simbiont gibi bitki belirli bileşenleri içermez. Bu bileşenler eksikse, gen ifade profilleri değiştirilebilir. Bu etkiler çalışma için önemli ise larva kısmen veya tamamen ev sahibi bitki üzerinde yetiştirilen olabilir. Beslenme deneylerinden birkaç saat önce böceklerden gıda stopajı, beslenme davranışlarını da artırabilir. Alan tarafından toplanan larvalar, uygun trofik seviyelere maruz kaldığında da sağlam ve avantajlı olabilir, ancak tüm çalışmalar için uygun olabilecek veya olmayan başka bir değişken ekliyor.
Sağlıklı, böcek ve pestisit içermeyen bitkilerin üretimi de önemlidir. Virüsler, böcek zararlıları ve mantar organizmaları olan bitkiler, tekrarlanabilir veriler elde etmek için bir zorluk sunar.
Birçok larva instars, patates bitki yaş ve yaprak boyutları belirli bir çalışma türü için protokol özelleştirmek için kombine edilebilir. İstila ve hasat süreleri de ayarlanabilir. Potansiyel olarak, tüm bitki gözlemleri temel olarak kullanılırsa, diğer birçok bitki böcek etkileşimi müstakil yapraklar kullanılarak incelenebilir. Müstakil yaprak tahlil gen ifadesi analiz etmek için tüm bitki otoburluğu çalışmalar için ilgili ve değerli bir alternatiftir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan böcekler ve larva evrelendirme konusunda uzmanlık için Bob Farrar ve Alexis Park 'a teşekkür etmek ister. El yazması kritik İnceleme için Michael Blackburn ve Saikat güneş ek teşekkürler.
Bu yayındaki ticari isimlerden veya ticaret ürünlerinden Bahsedilmek sadece belirli bilgileri sağlamak amacıyla yapılır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay anlamına gelmez.
USDA bir eşit fırsat sağlayıcı ve Işveren olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
