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Detached पत्ता परख चबाने कीट Manduca sexta द्वारा संक्रमण के दौरान आलू में जीन अभिव्यक्ति अध्ययन को सरल बनाने के लिए

Published: May 15, 2019 doi: 10.3791/59153
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Lab, United States Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service (ARS), 2Genetic Improvement for Fruits and Vegetables Lab, USDA-ARS

Summary

प्रस्तुत विधि आलू की पत्तियों को Manduca sexta लार्वा के आवेदन के माध्यम से प्राकृतिक शाकाहारी क्षतिग्रस्त संयंत्र ऊतक बनाता है. संयंत्र ऊतक कीट जड़ी बूटी के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रियाओं में शामिल छह प्रतिलेखन कारक homologs की अभिव्यक्ति के लिए परख गया है.

Abstract

कीट जड़ी बूटी के जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के multitrophic प्रकृति जैविक प्रतिकृति की बड़ी संख्या की मांग, सरल, अधिक सुव्यवस्थित जड़ी बूटी प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत पैदा. चबाने वाले कीटों के क्षोभ का अध्ययन आमतौर पर संपूर्ण पादप प्रणालियों में किया जाता है। हालांकि इस पूरे जीव रणनीति लोकप्रिय है, यह आवश्यक नहीं है अगर इसी तरह की टिप्पणियों एक अलग पत्ती में दोहराया जा सकता है. धारणा यह है कि संकेत transduction के लिए आवश्यक बुनियादी तत्वों पत्ती के भीतर ही मौजूद हैं. संकेत transduction में जल्दी घटनाओं के मामले में, कोशिकाओं को केवल क्षोभ से संकेत प्राप्त करने और पड़ोसी कोशिकाओं जो जीन अभिव्यक्ति के लिए परख रहे हैं करने के लिए उस संकेत संचारित करने की जरूरत है.

प्रस्तावित विधि बस टुकड़ी के समय में परिवर्तन. पूरे पौधे के प्रयोगों में, लार्वा एक ही पत्ती तक ही सीमित होते हैं जो अंततः पौधे से अलग हो जाते हैं और जीन अभिव्यक्ति के लिए परख लगाते हैं। यदि उच्छेदन के क्रम को उलट दिया जाता है, पूरे संयंत्र अध्ययन में पिछले से, अलग अध्ययन में पहले करने के लिए, खिला प्रयोग सरल है.

सोलनम ट्यूबरोसम var. केनेबेक को एक सरल ऊतक संस्कृति माध्यम में नोडल हस्तांतरण द्वारा प्रचारित किया जाता है और यदि वांछित हो तो आगे के विकास के लिए मिट्टी में स्थानांतरित किया जाता है। पत्तियों को मूल संयंत्र से निकाला जाता है और पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित किया जाता है जहां भोजन परख एम सेक्स्टाके लार्वा चरणों के साथ आयोजित की जाती है . क्षतिग्रस्त पत्ती ऊतक संकेत transduction में अपेक्षाकृत जल्दी घटनाओं की अभिव्यक्ति के लिए परख है. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण संक्रमण-विशिष्ट Cys2-His2 (C2H2) प्रतिलेखन कारकों की पहचान की, जल्दी प्रतिक्रिया अध्ययन में अलग पत्तियों का उपयोग करने की सफलता की पुष्टि. विधि पूरे संयंत्र infestations की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है और कम जगह का उपयोग करता है.

Introduction

हर्बीवरी आणविक घटनाओं की एक श्रृंखला है जिसके दौरान एक संयंत्र दोनों हमले की पहचान कर सकते हैं और अपने अस्तित्व के लिए एक उचित प्रतिक्रिया माउंट गति में सेट. एक पौधे चबाने कीड़े से दो बुनियादी संकेत प्राप्त करता है; एक ऊतक को शारीरिक क्षति से और दूसरा कीट-विशिष्ट पदार्थों से। नुकसान से जुड़े आणविक पैटर्न (DAMPs) लार्वा mouthparts द्वारा बनाई गई क्षति के जवाब में जारी कर रहे हैं और एक अच्छी तरह से परिभाषित घाव प्रतिक्रिया है कि हार्मोन जैस्मोनिक एसिड में वृद्धि और रक्षा जीन के प्रतिलेखन में परिणाम ट्रिगर1. सबसे प्रसिद्ध DAMPs में से एक systemin, एक पॉलीपेप्टाइड है कि एक पत्ती के बाद बड़ा प्रोसिस्टमिन प्रोटीन के दरार से बनता है2,3घायल है. जैस्मोनिक एसिड घाव प्रतिक्रिया आगे शाकाहारी संबद्ध आणविक पैटर्न (HAMPs), जो कैटरपिलर लार, आंत सामग्री (पुनर्गुण) और मल (Fras)4से प्राप्त किया जा सकता द्वारा संग्राहक है। कीट इन पदार्थों का उपयोग रक्षा प्रतिक्रिया5को बढ़ावा देने या उससे बचने के लिए करते हैं . ट्रांसक्रिप्शन कारक तो डाउनस्ट्रीम रक्षा जीन6,7,8के विनियमन के माध्यम से रक्षा प्रतिक्रिया में हार्मोन संकेतों से संदेश रिले .

प्रयोगशाला सेटिंग्स में इस्तेमाल कुछ संयंत्र कीट बातचीत अध्ययन नकली प्रकार के हैं, कीट द्वारा खिलाने की प्राकृतिक विधि लगभग के लक्ष्य के साथ. नकली जड़ी बूटी आमतौर पर विभिन्न उपकरणों के साथ संयंत्र के ऊतकों को कृत्रिम क्षति बनाने के द्वारा पूरा किया जाता है जो DAMPs की रिहाई का कारण बनने और रक्षा जीनों के उत्पादन को ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त कीट mouthparts के विशिष्ट तंत्र की नकल करते हैं। अन्य कीट-विशिष्ट घटक जैसे मुख स्राव या पुनरुत्पादक को प्रायः हैम्प्स9,10,11से अंशदान को दोहराने के लिए मिलाया जाता है . एक विशिष्ट आकार और घाव के प्रकार और HAMPs की सटीक मात्रा के आवेदन के निर्माण के अध्ययन के इन प्रकार के लिए एक लाभ है और अधिक reproduible परिणाम की पेशकश कर सकते हैं. प्राकृतिक जड़ी बूटी अध्ययन, जहां संयंत्र के ऊतकों को नुकसान क्षेत्र प्राप्त या प्रयोगशाला-आहार कीड़े के आवेदन द्वारा पूरा किया जाता है, अक्सर अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि घाव आकार और HAMP मात्रा कीट व्यवहार द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं और परिवर्तनशीलता जोड़ने के लिए डेटा. साहित्य12,13,14में प्राकृतिक बनाम नकली तरीकों और उनके फायदे और नुकसान पर अच्छी तरह से बहस हो रही है .

प्रतिलेखन कारकों जैसे प्रारंभिक संकेतन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, पत्ती का एक निश्चित प्रतिशत अपेक्षाकृत कम समय में सेवन किया जाना चाहिए, इसलिए लार्वा को तुरंत चबाना शुरू कर देना चाहिए और विश्लेषण के लिए जमे हुए होने तक खपत को बनाए रखना चाहिए। एम sexta अपने लार्वा चरणों में से कई के दौरान कई solanaceous पौधों पर एक voracious फीडर है, यहसमय 15की एक अपेक्षाकृत कम राशि में अधिकतम नुकसान प्रदान करने के लिए आदर्श बना रही है. प्रारंभिक संकेतन घटनाओं का अध्ययन करते समय यह सुविधाजनक होता है क्योंकि किसी कीट के संपर्क में आने के लगभग तुरंत बाद पौधे की प्रतिक्रिया होती है जो पत्ती की सतह16,17 . रोकथाम के आमतौर पर इस्तेमाल किया क्लिप पिंजरे विधि अनाड़ी साबित होता है, के रूप में कई पिंजरों को हटाने या लार्वा के अलावा के लिए अनुमति देने के लिए प्रयोग भर में निरंतर समायोजन की आवश्यकता होगी. पत्तियों को भी काफी बड़ा और मजबूत होना चाहिए जो एक ही समय में खिलाने वाले कई कीड़ों का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है। आलू के पौधों के इन प्रकार के भोजन का निरीक्षण करने के लिए अंतरिक्ष की एक बड़ी राशि की आवश्यकता होती है। लार्वा अक्सर पत्ती की सतह के नीचे स्थानांतरित हो जाता है जो भोजन अवलोकन को काफी मुश्किल बना देता है। इन प्रयोगों को करने के लिए पूरे पौधों का उपयोग स्पष्ट रूप से बोझिल है.

वर्तमान अध्ययन को कारगर बनाने और जड़ी बूटी का अध्ययन करने के लिए पूरे संयंत्र दृष्टिकोण को सरल बनाने के लिए पूरे पौधों के बजाय पेट्री व्यंजनों में अलग अलग पत्तियों का उपयोग करता है। इस अध्ययन में प्रोटोकॉल का आवेदन एम सेक्स्टा लार्वा द्वारा शाकाहारी क्षति के बाद आलू की पत्तियों में जल्दी प्रेरित C2H2 प्रतिलेखन कारकों के एक समूह के अवलोकन तक सीमित है।

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Protocol

नोट: निम्न प्रोटोकॉल, एक व्यक्ति को सेट अप अवलोकन करने और नमूने एकत्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक ही सेटअप के एकाधिक रन जैविक प्रतिकृति बढ़ाने के लिए संयुक्त किया जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति पर संभावित दैनिक प्रभावों को समाप्त करने के लिए प्रयोग की कोई अतिरिक्त पुनरावृत्ति दिन के एक ही समय में स्थापित की जानी चाहिए। प्रोटोकॉल 5 अलग फसल समय अंक के लिए 3 'प्रभावित' पत्ते बनाने के लिए बनाया गया है। प्रत्येक समय बिंदु के लिए मिलान किए गए नियंत्रण पत्ते कुल 30 नमूने बनाएँ. प्रयोग पत्ती आकार और लार्वा चरणों की एक किस्म के साथ किया जा सकता है, लेकिन यह सिफारिश की है कि पत्ती का आकार, लार्वा चरण और उपद्रव समय प्रक्रिया भर में संगत हो.

1. आलू के पौधों की तैयारी

नोट: बाँझ तकनीक की आवश्यकता होती है सभी चरणों एक ऊतक संस्कृति हुड18,19में किया जाना चाहिए .

  1. एक्सप्लांट स्रोत से केनेबेक पौधों को तैयार करें।
    1. प्रचार माध्यम तैयार करें।
      1. विटामिन पाउडर के साथ 4.43 ग्राम मुरशीज और स्कोग (एमएस) जोड़ें, 20 ग्राम सुक्रोज और 2 ग्राम एगार विकल्प रिवर्स असमस (आरओ) के 1 एल के लिए एक स्पिन बार के साथ 2 एल फ्लास्क में शुद्ध पानी। एक हलचल थाली और मिश्रण करने के लिए फ्लास्क स्थानांतरण। हलचल जारी रखते हुए NaOH का उपयोग कर 5.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
        नोट: आगर जब तक autoclaved भंग नहीं होगा.
      2. 20 मिनट (121 डिग्री सेल्सियस, 101.3 केपीए) के लिए तरल चक्र पर परिरक्षक/बायोसाइड और ऑटोक्लेव का 1 एमएल जोड़ें। चक्र समाप्त होने के तुरंत बाद ऑटोक्लेव से माध्यम निकालें और इसे 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। बाँझ संस्कृति वाहिकाओं (उदा., मैजेंटा या प्लांटकॉन) एक ऊतक संस्कृति हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए बाँझ और ठंडा प्रचार माध्यम के 100 एमएल स्थानांतरण।
    2. एक्सप्लांट सामग्री तैयार करें।
      1. केनेबेक बीज आलू के रूप में एक्सप्लांट स्रोत प्राप्त करें और नल एच2ओ के साथ धोने से मिट्टी के सभी निशान को हटा दें। अंकुरित स्प्राउट्स निकालें और एक बाँझ स्केलपेल के साथ 2 सेमी टुकड़ों में काट लें।
      2. 70% इथेनॉल में 15 s के लिए भिगोने से अंकुरित टुकड़े स्टरलाइज़ करें, इसके बाद 1:1 ब्लीच (1 भाग आरओ-पानी: 1 भाग केंद्रित रोगाणुनाशक/वाणिज्यिक ग्रेड ब्लीच) में 13 मिनट के बाद। बाँझ एच2हे में 5 बार कुल्ला।
      3. बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक ऊतक संस्कृति हुड में प्रचार माध्यम के साथ बाँझ ऊतक संस्कृति वाहिकाओं के लिए मलत्याग सामग्री स्थानांतरण। एक संयंत्र ऊतक संस्कृति कक्ष में जहाजों स्थानांतरण और 2 के लिए बढ़ने 2 $u20123 सप्ताह या जब तक plantlets 24 डिग्री सेल्सियस, 16 एच प्रकाश (140 [मोल]m-2[s-1)/8 h अंधेरे photoperiod पर फार्म।
  2. नोडल-प्रोपेक्टक् ट कल्चर आलू के पौधे तैयार करें।
    1. नोडल स्थानांतरण माध्यम तैयार करें।
      नोट: यह 10 ऊतक संस्कृति वाहिकाओं जो एक ही दिन इस्तेमाल किया जा सकता है या समय से पहले किया जा सकता है और नोडल हस्तांतरण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर देगा.
      1. एक स्पिन पट्टी के साथ एक 2 एल फ्लास्क में आरओ-शुद्ध पानी के 1 एल में 36.43 ग्राम पोषक तत्व ऐगार मिश्रण जोड़ें। एक हलचल थाली और मिश्रण करने के लिए फ्लास्क स्थानांतरण। हलचल जारी रखते हुए KOH का उपयोग कर5.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
        नोट: आगर जब तक autoclaved भंग नहीं होगा.
      2. 20 मिनट (121 डिग्री सेल्सियस, 101.3 के.पीए) के लिए तरल चक्र पर ऑटोक्लेव। चक्र समाप्त होने के तुरंत बाद ऑटोक्लेव से माध्यम निकालें और इसे 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। बाँझ ठंडा नोडल हस्तांतरण मध्यम बाँझ संस्कृति वाहिकाओं के लिए 100 एमएल स्थानांतरण (सामग्री की मेजदेखें) एक ऊतक संस्कृति हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग कर.
    2. नोडल कटिंग तैयार करें।
      1. एक्सप्लांट सामग्री से उगाए गए केनेबेक पौधों को प्राप्त करें (चरण 1-1-2 में उत्पादित)। प्लांटलेट में कम से कम 3 से 4 नोड (शाखा बिंदु) होना चाहिए। बाँझ कैंची या स्केलपेल का उपयोग कर पत्तियों को निकालें। मुख्य तने के पास शाखाओं को काटें, जिससे लगभग 2 मिमी शाखा ऊतक होते हैं।
      2. प्रत्येक शाखा बिंदु या नोड के ऊपर और नीचे लगभग 2 मिमी काटने से स्टेम से नोडल वर्गों निकालें। नोडल हस्तांतरण माध्यम (चरण 1.2.1.2) में उत्पादित एक बाँझ ऊतक संस्कृति पोत में नोडल cutings की व्यवस्था पिछले पोत (शाखा की ओर इशारा करते हुए) के रूप में एक ही अभिविन्यास में.
      3. एक संयंत्र ऊतक संस्कृति कक्ष के लिए नोडल cutings के साथ जहाजों स्थानांतरण और 24 डिग्री सेल्सियस, 16 एच प्रकाश (140 [मोल ]m-2[s-1)/8 एच अंधेरे photoperiod पर 2 के लिए विकसित।
        नोट: प्रत्येक नोडल काटने एक नया संयंत्र के रूप में विकसित होगा। प्रत्येक पात्र में काटने की संख्या पत्ती का आकार निर्धारित करता है। प्रति पोत स्थानांतरित कम cutings बड़ा पत्तियों में परिणाम होगा. प्रति पोत तीन पौधों में 15 मिमी x 20 मिमी पत्तियां 2 $u20123 सप्ताह में होंगी।
  3. (वैकल्पिक) मिट्टी से उगाए गए केनेबेक आलू के पौधे तैयार करें।
    नोट: बड़ी पत्तियों का उत्पादन करने के लिए, नोडल प्रचारित आलू के पौधों को मिट्टी में स्थानांतरित किया जा सकता है।
    1. नोडल हस्तांतरण माध्यम में उगाए गए आलू के पौधों को धीरे से पौधे को माध्यम से तब तक खींचकर स्थानांतरित करें जब तक कि सभी जड़ ऊतक आगर से मुक्त न हो जाएं।
    2. जड़ों से 1 नोड के ठीक ऊपर मिट्टी में स्थानांतरण करें और प्रत्यारोपण के आसपास मिट्टी को हल्के से पैक करें। जड़ प्रणाली के साथ मिट्टी संपर्क सुनिश्चित करने के लिए धीरे से पानी।
    3. 16 एच प्रकाश (140 डिग्री सेल्सियस-2]s-1)/8 h अंधेरे फोटो अवधि और 25/20 डिग्री सेल्सियस दिन/रात के तापमान के साथ एक विकास कक्ष में रखें।
      नोट: पौधों के लिए तैयार हैं जब शीर्ष दो पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों परख के लिए उपयुक्त आकार तक पहुँच गए हैं.
  4. (वैकल्पिक) कंद उगाए गए आलू के पौधे तैयार करें।
    नोट: कंदों से उगाए जाने वाले आलू के पौधे बड़े और अधिक मजबूत होते हैं और पौधों पर लार्वा पालन करने या रात भर लार्वा खिलाने की इच्छा होने पर उपयोगी हो सकते हैं।
    1. मिट्टी मिश्रण युक्त बर्तन में एक 10 में गहरी में एक आलू कंद 6 प्लेस 10 एमएल गोली धीमी रिलीज उर्वरक के साथ पूरक.
    2. 16 एच प्रकाश (140 डिग्री सेल्सियस-2]s-1)/8 h अंधेरे फोटो अवधि और 25/20 डिग्री सेल्सियस दिन/रात के तापमान के साथ एक विकास कक्ष में रखें। कंद रोपण से पौधे लगभग 30$u201240 दिन के लिए तैयार हैं।
      नोट: पौधों है कि फूल शुरू कर दिया है का उपयोग न करें।

2. भोजन के लिए कीड़ों की तैयारी

  1. एम सेक्स्टाकी वांछित लार्वा अवस्था प्राप्त करें .
    नोट: इस अध्ययन के लिए लार्वा 5 इनस्टार20 के माध्यम से कृत्रिम आहार पर पाला और घर में कीट से एक अनुभवी व्यक्ति द्वारा मंचन किया गया। लार्वा भी आंशिक रूप से या पूरी तरह से पौधे के ऊतकों पर पाला जा सकता है। लार्वा मोल्ट से ठीक पहले नहीं खाते हैं और मोल्ट के ठीक बाद खाने की संभावना सबसे अधिक होती है, इसलिए उपयुक्त मंचन महत्वपूर्ण21होता है।
  2. लार्वा के आकार के आधार पर एक उपयुक्त रोकथाम पोत (उदाहरण के लिए, 6-, 12,, 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति पकवान) में लार्वा स्थानांतरित करें। पकवान में एक लार्वा प्रति अच्छी तरह से होना चाहिए।
    नोट: लार्वा एक खाद्य स्रोत के बिना क्षेत्रीय या नरभक्षी व्यवहार प्रदर्शित कर सकते हैं और अगर एक साथ रखे गए घायल हो सकते हैं।
  3. (वैकल्पिक) लार्वा को 2 एच तक के लिए भूखा रखना क्योंकि इससे लार्वा फीडिंग में सुधार हो सकता है।
    नोट: लार्वा इस समय के दौरान विकास कक्ष में संग्रहीत एक रोकथाम पोत में होना चाहिए।

3. उपद्रव प्रयोग के लिए घटक सेटअप

नोट: चित्र 1में योजनाबद्ध सारांश देखें.

  1. प्रत्येक हार्वेस्ट समय बिंदु के लिए प्लेसमेंट टेम्पलेट बनाएँ.
    नोट: यह प्रत्येक फसल समय बिंदु के लिए 5 अलग ट्रे स्थापित करने के लिए उपयोगी है। यह संगठित नमूने रहता है और व्यंजन उनकी व्यवस्था को बदलने के बिना एक सेट के रूप में और अधिक कुशलता से चारों ओर ले जाया जा करने के लिए अनुमति देता है. यदि प्रतिशत के नुकसान की गणना की जाएगी, यह पहले के रूप में आवश्यक है और बाद में संक्रमण छवियों को एक ही फोकल लंबाई पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए.
    1. प्राप्त 5 मजबूत ट्रे छह उचित आकार पेट्री व्यंजन और सफेद कागज के साथ लाइन का एक सेट धारण करने में सक्षम.
      नोट: पेट्री डिश का आकार खिला परख के लिए चुना पत्ती आकार पर आधारित है। पत्ती पक्षों को छूने के बिना पकवान में आसानी से फिट होना चाहिए. उदाहरण के लिए, एक 60 मिमी x 15 मिमी पकवान लंबाई या चौड़ाई में 50 मिमी तक पत्तियों के लिए उपयुक्त है।
    2. प्रत्येक ट्रे में कागज पर उचित आकार पेट्री डिश का उपयोग कर छह हलकों का एक सेट ट्रेस. हलकों के एक सेट 'नियंत्रण' ए, बी और सी और अन्य 'प्रभावित' ए, बी, और सी लेबल। इसके अलावा उचित फसल समय के साथ प्रत्येक प्लेसमेंट टेम्पलेट लेबल।
  2. (वैकल्पिक) 'इंफेक्शन से पहले' और 'इंफेक्शन के बाद' छवि पर कब्जा करने के लिए एक कैमरा सेट करें।
    1. प्लेसमेंट टेम्पलेट में सभी पेट्री व्यंजनों की छवि पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त फोकल लंबाई पर एक स्टैंड पर एक कैमरा सुरक्षित करें।
  3. फसल के समय बिंदु ट्यूबलेबल.
    1. प्लेसमेंट टेम्पलेट में प्रत्येक वृत्त के संगत 30, 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का एक सेट लेबल करें। नलों को उचित रूप से क्षोभ (नियंत्रण/प्रभावित), संयंत्र प्रतिकृति पत्र (ए, बी या सी) और कटाई समय बिंदु (मिनट के बाद संक्रमण अवधि की संख्या) की पहचान करने के लिए लेबल।
  4. 3.1.1 कदम में चुना पेट्री व्यंजन तैयार करें।
    1. चरण 3.1.1 से 30 पेट्री व्यंजनों में से प्रत्येक में एक बाँझ फिल्टर पेपर डिस्क रखें। डिस्क को गीला करने के लिए बाँझ पानी जोड़ें; पकवान में पूल करने के लिए अतिरिक्त पानी की अनुमति नहीं है. प्रत्येक प्लेसमेंट टेम्पलेट में छह हलकों में से प्रत्येक में प्रत्येक डिश रखें।
    2. प्रत्येक प्लेसमेंट टेम्पलेट के बगल में तीन आलू के पौधों को स्थिति दें। सुनिश्चित करें कि पौधों सभी एक ही उम्र और रिश्तेदार आकार रहे हैं।

4. उपद्रव प्रदर्शन

नोट: एक कटनी समय बिंदु/प्लेसमेंट टेम्पलेट एक समय में सेट किया गया है।

  1. बाँझ कैंची के साथ प्रत्येक संयंत्र से शीर्ष दो आकार मिलान पत्तियों निकालें और नियंत्रण पेट्री डिश में एक पत्ता और प्रत्येक संयंत्र (ए, बी और सी) के लिए प्रभावित पेट्री डिश में एक जगह है। जितनी जल्दी हो सके इस प्रक्रिया को पूरा करें।
  2. (वैकल्पिक) एक 'इंफेस्टेशन से पहले' छवि पर कब्जा करने के लिए कैमरे के स्टैंड पर प्लेसमेंट टेम्पलेट स्थानांतरित करें।
  3. जितनी जल्दी हो सके नरम स्पर्श संदंश का उपयोग कर प्रत्येक प्रभावित पकवान के लिए लार्वा स्थानांतरण। वांछित 'उपद्रव' समय के लिए टाइमर सेट करें।
    नोट: समय की अवधि जब लार्वा पत्ती ऊतक का उपभोग कर रहे हैं 'इंफेक्शन समय' है। यह कुछ ऐसा है जिसे वास्तविक संक्रमण के शुरू होने से पहले कुछ परीक्षण पत्तियों/लार्वा का उपयोग करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है। चुना 'इंफेक्शन समय' सभी प्रभावित पत्तियों के लिए संगत होना चाहिए।
    नोट: लार्वा नरम स्पर्श संदंश द्वारा देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए। 2 के माध्यम से 4 instar उनके सींग या midection द्वारा धीरे से समझा जा सकता है.
  4. सभी लार्वा खा रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए भोजन का निरीक्षण करें। लार्वा को खिलाने के व्यवहार के आधार पर जोड़ा जाना चाहिए/हटाया जाना चाहिए। पेट्री व्यंजन पर ढक्कन जितना संभव हो उतना रखें।
    नोट: एक से अधिक लार्वा प्रति पत्ती इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. उपद्रव के समय के अंत में पत्तियों से लार्वा निकालें। फसल के समय के लिए टाइमर प्रारंभ करें।
  6. (वैकल्पिक) 'के बाद उपद्रव' छवि पर कब्जा करने के लिए कैमरे के स्टैंड के लिए प्लेसमेंट टेम्पलेट स्थानांतरण।
    नोट: प्लेसमेंट टेम्पलेट में सभी छह पत्ते विशिष्ट फसल समय पर काटा जाता है।

5. कटाई के पत्ते

  1. प्रत्येक पत्ती को प्रत्येक फसल समय बिंदु के अंत में संगत लेबल वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूब को द्रव छ2में डालकर तत्काल स्थिर कर दें। आरएनए के अलगाव तक -80 डिग्री सेल्सियस पर काटा संयंत्र ऊतक स्टोर।
  2. प्रत्येक कटनी समय बिंदु के लिए चरण 4$u20125.1 दोहराएँ।

6. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण पत्ती ऊतक

  1. जमे हुए पत्ती के ऊतकों को एक माइक्रोपेस्टल के साथ पाउडर में पीस लें।
  2. जीन अभिव्यक्ति के लिए कुल आरएनए और प्रक्रिया को अलग करें जैसा कि पहले22बताया गया था .

7. (वैकल्पिक) पत्ती क्षति का आकलन

  1. दृष्टि से पत्ती क्षति के प्रतिशत का अनुमान है या पहले और बाद में संक्रमण छवियों में पत्ती क्षेत्र की गणना.
  2. सॉफ्टवेयर उपकरणों के साथ पत्ती क्षेत्र को मापने (उदा., Phenophyte)23.
  3. पत्ती क्षेत्र माप से, के रूप में नुकसान के प्रतिशत की गणना
    % क्षति [ (लीफ क्षेत्र से पहले - पत्ती क्षेत्र के बाद) /

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Representative Results

पत्ता खपत प्रोटोकॉल की सफलता को परिभाषित करता है. स्वस्थ, सही ढंग से मंचित लार्वा को पत्ती की सतह पर प्लेसमेंट के तुरंत बाद भोजन शुरू करना चाहिए और संक्रमण के समय भर में काफी सुसंगत तरीके से भोजन करना चाहिए। वीडियो 1में, शीर्ष पर लार्वा प्लेसमेंट के तुरंत बाद चबाना शुरू होता है और खिलाने के दौरान एक सुसंगत दर बनाए रखता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर उपद्रव के बाद जल्दी जीन अभिव्यक्ति की घटनाओं पर ासाकी़. नीचे का लार्वा किसी भी पत्ती सामग्री का उपभोग नहीं करता था और यह एक असफल संक्रमण का एक उदाहरण है।

पर्याप्त क्षति का उत्पादन किया है यह सुनिश्चित करने के लिए पत्ती की खपत के दौरान दृश्य सन्निकटन ोंकीमों की निगरानी कर रहे हैं. उपयोग की गई पत्ती सामग्री की मात्रा की गणना संक्रमण से पहले और बाद में पत्तियों की छवियों का उपयोग करके क्षति के प्रतिशत के रूप में की जा सकती है। चित्र 2 विभिन्न प्रकार के आलू पौधों पर एम सेक्स्टा लार्वा के विभिन्न विकासात्मक चरणों द्वारा उपभोग की चर दरों को दर्शाता है। चित्र 2A में पत्तियों को 2 सप्ताह पुराने नोडल-प्रोपेल्ड ऊतक संस्कृति पौधों से अलग किया गया था। इस आकृति में सभी पत्ते एक ही आकार के हैं, लेकिन 5 मिनट के लिए लार्वा के विभिन्न चरणों द्वारा उपद्रव के अधीन थे चित्र 2A:I-IV, वीडियो 2, वीडियो 3, वीडियो 4, और वीडियो 5 की विभिन्न दरों को दर्शाता है संक्रमण के एक हिस्से से प्रत्येक लार्वा चरण के लिए खपत और खिला ने शैलियों। यह प्रत्येक पत्ती और लार्वा चरण संयोजन का उपयोग करके कितना नुकसान संभव है यह निर्धारित करने में सहायक है और पुराने लार्वा की घृणित प्रकृति को दिखाता है। 1 इनस्टार लार्वा के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि उनकी मैन्डिबल्स 5 मिनट के संक्रमण खिड़की में नुकसान का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त विकसित नहीं हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऊतक-संस्कृति से प्राप्त छोटी अधिक कोमल पत्तियां अक्सर लार्वा के लिए अधिक स्वादिष्ट होती हैं। इन परिणामों के आधार पर, 4 instar लार्वा आगे अधिक परिपक्व, मिट्टी से उगाए गए आलू के पौधों से पत्तियों को नुकसान का आकलन करने के लिए चुना गया था। मिट्टी के उगे पौधे खेत में प्राप्त पौधों को अधिक निकटता से प्राप्त करते हैं। चित्र 2ख क्षति की सीमा को दर्शाता है जब 3 और 4 इनस्टार लार्वा मिट्टी में उगाए गए आलू के पौधों से अलग पत्तियों पर लागू किए जाते थे। दो सप्ताह पुराने नोडल प्रचारित पौधों को मिट्टी में प्रत्यारोपित किया गया और एक अतिरिक्त 3 सप्ताह के लिए उगाया गया। मिट्टी के बड़े पौधों से क्षतिग्रस्त पत्ते तीन समूहों में गिर गए; 15-20%, 20-30%, और 30-40%. प्रत्येक समूह में तीन पत्ते प्रत्येक श्रेणी के लिए नुकसान के विभिन्न स्तरों का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाए जाते हैं। अधिक परिपक्व मिट्टी से विकसित पौधों की पत्तियों को अधिक लार्वा लागू करने की आवश्यकता होती है और युवा नोडल-प्रपादित पौधों से पत्तियों में पाए जाने वाले नुकसान के समान स्तर तक पहुंचने के लिए लंबे समय तक संक्रमण का समय होता है। इन परिणामों के पौधों के विभिन्न प्रकार से सफल जड़ी बूटी से संभव परिणामों की सीमा वर्णन.

सफल जड़ी बूटी के बाद पूरा हो गया है और प्रतिशत नुकसान का आकलन किया है, पत्ती ऊतक जीन अभिव्यक्ति के लिए परख है. जीन अभिव्यक्ति परिणाम एक मजबूत प्रेरण या संक्रमण के जवाब में शामिल प्रतिलिपि के दमन का संकेत देना चाहिए. चित्र 3 अलग पत्तियों में एक सफल जड़ी बूटी प्रयोग से छह C2H2 प्रतिलेखन कारकों की जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल दिखाता है. C2H2 जस्ता उंगली St$FP2 पिछले पूरे संयंत्र अध्ययन24में आलू में एम sexta herbivory द्वारा प्रेरित किया गया था . हालांकि अलग पत्ती परख में जड़ी बूटी द्वारा प्रेरित किया गया था, जब अलगाव ही के प्रभाव की तुलना में संक्रमण महत्वपूर्ण नहीं था। हालांकि, दो अन्य St$FP2 homologs, St$FP5 और St$FP7,काफी 40 और 80 मिनट पोस्ट जड़ी बूटी पर प्रेरित किया गया जब अलग नियंत्रण की तुलना में. StLOX3 और StMYC2 दोनों घाव और जड़ी बूटी द्वारा प्रेरित मार्कर जीन हैं और जैस्मोनिक एसिड विनियमित रक्षा रास्ते की भागीदारी का संकेत मिलता है. इस विशेष अध्ययन का लक्ष्य उम्मीदवार जीन के एक पैनल के बीच उपद्रव-प्रतिक्रियात्मक प्रतिलेखन कारकों की पहचान करना था। दो C2H2 जस्ता उंगली प्रतिलेखन कारकों है कि मजबूत एम sexta herbivory के लिए उत्तरदायी हैं की पहचान उपद्रव परख के लिए अलग पत्तियों के उपयोग का समर्थन करता है.

Figure 1
चित्र 1: संक्रमण प्रोटोकॉल के लिए Flowchart. प्रोटोकॉल के संक्रमण अनुभाग के प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह में शामिल चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एम सेक्स्टा लार्वा के कारण पत्ती क्षति। (क) ऊतक-संस्कृति के पत्तों को 5 मिनट से अधिक के प्रत्येक लार्वा चरण में प्रतिशत क्षति, रोमन अंक I-IV क्रमशः 2-5 वीडियो का संदर्भ देता है जो प्रत्येक इनस्टार को चित्र वाले पत्ते पर खिलाते हुए दिखाता है। (बी) मिट्टी से उगी पत्तियों को 20 मिनट से अधिक की दूरी पर 4 इंच तक नुकसान की सीमा. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पत्तियों का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। वास्तविक समय मात्रात्मक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-QPCR) C2H2 जस्ता उंगली प्रतिलेखन कारकों के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण दिखाया गया है। माध्य प्रतिलिपि स्तर है, 2[CT के साथ ([CT ] परीक्षण जीन की सीटी - exogenous नियंत्रण जीन की सीटी). (नीले) में उत्पादित नियंत्रण पत्तियों और (लाल) में excised प्रभावित पत्तियों हर समय बिंदु पर दिखाए जाते हैं. प्रत्येक मूल्य तीन जैविक प्रतिकृति का औसत है. तीन तरह से ANOVA $Ct मूल्यों पर आयोजित किया गया था. समय के साथ नियंत्रण पत्तियों में महत्वपूर्ण अंतर पूंजी पत्र के साथ संकेत कर रहे हैं. समय के साथ प्रभावित पत्तियों में महत्वपूर्ण अंतर कम मामले पत्र में संकेत दिया जाता है. नियंत्रण और प्रभावित पत्तियों के बीच एक ही समय बिंदु पर महत्वपूर्ण अंतर एक तारांकन (*) के साथ दिखाया गया है। Pr gt; F मान सभी 0.001 से कम थे, 0.0086 के साथ St$FP6 नियंत्रण उपचार के लिए छोड़कर. त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. NCBI पहुंच संख्या हैं: StLOX3-X96406.1, St$FP2- MK809525, St$FP4-CV500970.1, St$FP6-DN587601.1, St$FP7-DN590005.1. Spud DB accession numbers from$lt;http://solanaceae.plantbiology.msu.edu और हैं StMYC2-PGSC0003DMT400045204, St$FP3-PGSC0003DMT40004014. यह आंकड़ा22से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Video 1
वीडियो 1: लार्वा खिलाने की वीडियो क्लिप| दूसरा instar एम sexta लार्वा खिला (ऊपर) और नहीं खिला (नीचे) दो सप्ताह पुराने ऊतक संस्कृति से एक पत्ती पर आलू के पौधे हो. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 2
वीडियो 2: चित्रा 2A वीडियो क्लिप (मैं) लार्वा खिला की. दूसरा इनस्टार एम सेक्स्टा लार्वा दो सप्ताह पुराने ऊतक संस्कृति से एक पत्ती पर खिला आलू के पौधे हो गया. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 3
वीडियो 3: लार्वा खिला के चित्र 2A वीडियो क्लिप (II)। तीसरा इनस्टार एम सेक्स्टा लार्वा दो सप्ताह पुराने ऊतक संस्कृति से एक पत्ती पर खिला आलू के पौधे हो गया. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 4
वीडियो 4: चित्रा 2A वीडियो क्लिप (III) लार्वा खिला के| दो सप्ताह पुराने ऊतक संस्कृति से एक पत्ती पर खिला चौथा instar एम sexta लार्वा आलू के पौधे हो गया. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video 5
वीडियो 5: लार्वा खिला के चित्र 2A वीडियो क्लिप (IV)। पांचवें इनस्टार एम सेक्स्टा लार्वा दो सप्ताह पुराने ऊतक संस्कृति से एक पत्ती पर खिला आलू के पौधे हो गया. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

मौजूदा पूरे संयंत्र जड़ी बूटी के तरीके का उपयोग इस विशेष अध्ययन के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए अनावश्यक है (यानी, संक्रमण के लिए उनकी प्रतिक्रिया के लिए उम्मीदवार जीन का एक सेट स्क्रीन). अलग पत्ती शोधन के स्पष्ट लाभ समय यह जड़ी बूटी पराख प्रदर्शन करने के लिए लेता है छोटा है. क्लिप पिंजरों के साथ पूरे पौधों की unwieldy प्रकृति का सफाया कर दिया है और परख जल्दी ही प्रदर्शन कर रहे हैं, के बाद से पौधों के रूप में युवा के रूप में 2 सप्ताह के लिए फसल के पत्तों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी खिला और कम विकास कक्ष अंतरिक्ष के दौरान एक बहुत छोटे पदचिह्न की आवश्यकता है; दोनों महत्वपूर्ण है जब इन संसाधनों सीमित हैं.

इस परख की सीमा, अर्थात् टुकड़ी, का सामना करना पड़ता है जब रक्षा जीन अभिव्यक्ति परख है. detachment ही एक घाव प्रतिक्रिया का कारण बनता है और यह इसलिए क्या प्रभाव टुकड़ी रक्षा-जीन अभिव्यक्ति के बेसल स्तर पर है का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. नकली जड़ी बूटी शामिल एक अध्ययन में, एक प्रसिद्ध रक्षा जीन protease अवरोधक द्वितीय(PIN2) की प्रतिलिपि स्तर अप्रत्याशित रूप से अलग आलू की पत्तियों के नियंत्रण पत्तियों में उच्च होने की संभावना के कारण थे "पत्ती के संग्रह के दौरान घाव" 25. हालांकि, एम सेक्स्टा से कीट regurgitant के आवेदन पिन 2 जीन अभिव्यक्ति के स्तर को काफी बढ़ाया. यह उपद्रव प्रतिक्रिया से अलगाव के प्रभाव को चिढ़ाने के लिए नियंत्रण का उपयोग करने की आवश्यकता को दिखाता है।

Detached पत्ती परख अक्सर समय, स्थान और संसाधनों को बचाने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. इनका उपयोग गेहूं में कवक रोगों के प्रतिरोध के लिए जांच में किया गया है,26,27और सोयाबीन में कीट प्रतिरोध28 और चना29. इस परख को रोगजनक के अध्ययन में व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है जो आलूमेंदेर से अंगमारी का कारण बनता है 30,31. हाल ही में किए गए एक अध्ययन में पाया गया कि खेत32में देर से ब्लाइट प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए अलग - अलग पत्ती परख पूरे पौधे पराख के बराबर थी .

हालांकि, रक्षा-जीन अभिव्यक्ति के लिए परख के लिए अलग-अलग पत्तियों के उपयोग के लिए साहित्य में स्कैन सबूत मौजूद हैं। एक अध्ययन में अलग लीमा बीन33के मकड़ी के घुन के संक्रमण के जवाब में छह रक्षा जीनों का प्रोफाइल किया गया . पत्तियों ने ऐसी अस्थिरता का भी उत्पादन किया जिससे आस-पास के अनिर्णीत पत्तों में रक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया गया, जो पौधों में रक्षा-जीन अभिव्यक्ति की एक प्रसिद्ध रणनीति34थी। हमारे ज्ञान के लिए, कोई चबाने कीट जड़ी बूटी अध्ययन तिथि करने के लिए अलग पत्तियों का उपयोग जीन अभिव्यक्ति के लिए परख.

पहले से परिभाषित उपद्रव उत्तरदायी C2H2 जस्ता उंगली, St$FP2 काफी वर्तमान अलग पत्ती परख में संक्रमण से प्रेरित नहीं था. पूरे पौधे बनाम अलग पत्तियों के स्पष्ट अंतर के अलावा, पिछले अध्ययन में एक निरंतर प्रकार के संक्रमण का उपयोग किया गया जिसमें लार्वाकोहटाने के तुरंत बाद पौधे के ऊतकों को जीन अभिव्यक्ति के लिए परख दिया गया था। यह वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए संक्रमण के discontinuous प्रकार से अलग है, जहां लार्वा हटाने पत्ती फसल से पहले एक आराम अवधि के द्वारा पीछा किया गया था. इस वसूली की अवधि के दौरान, St$FP2 के स्तर में जल्दी से कमी और St$FP2 प्रेरण के एक निचले स्तर में परिणाम हो सकता है. वहाँ भी हो सकता है अन्य तो दूर अपरिभाषित प्रणालीगत संकेतन घटक है कि संवर्धित प्रेरण पूरे संयंत्र अध्ययन में मनाया में योगदान कर सकते हैं. एक और संभावना यह है कि 20 मिनट फसल के समय से पहले St$FP2 प्रतिलिपि चोटी हो सकता है. यह स्पष्ट है, तथापि, कि St$FP5 और St$FP7 प्रतिलिपि के प्रभावशाली प्रेरण उपद्रव प्रोटोकॉल के इस प्रकार के प्रासंगिक बनाते हैं. वर्तमान विधि की एक अन्य सीमा कॉर्न रूटवार्म जैसे रूट फीडिंग लार्वा का उपयोग करने में असमर्थता होगी। यह भी उपयुक्त नहीं होगा जब पूरे संयंत्र संचार जैसे जड़ से पत्ती संकेत35 या प्रणालीगत पत्तियों से संकेत36,37 का अध्ययन किया जा रहा है.

इस प्रोटोकॉल की सफलता प्रयोग में प्रयुक्त लार्वा की गुणवत्ता और सटीक मंचन पर काफी निर्भर करती है। पालन कौशल और एम sexta व्यवहार के बुनियादी ज्ञान उपयोगी लेकिन महत्वपूर्ण नहीं हैं. हालांकि, स्वस्थ, उचित रूप से चरणबद्ध लार्वा प्राप्त करने से सीधे खिला सफलता को प्रभावित किया जा सकता है। लार्वा एक शांत अवधि में प्रवेश करते हैं , जो प्रत्येक लार्वा मोल्ट से पहले होता है जिसके दौरान वे21को नहीं खिलाते . जाहिर है, इस तरह के लार्वा पत्ती के ऊतकों को नुकसान नहीं होगा। लार्वा का उपयोग करने के लिए आदर्श समय एक मोल्ट के बाद ही होता है। एक विशेष लार्वा चरण के कीटों के विकास के चरणबद्ध सहगण से जीन अभिव्यक्ति की पुनरुत्पादनीयता में भी सुधार होगा क्योंकि पौधे प्रत्येक विकासात्मक चरण में अलग-अलग प्रतिक्रिया दे सकते हैं।

लार्वा की आपूर्ति के लिए कीट-पतंगों तक पहुंच आदर्श होगी। एम सेक्स्टा अंडे या लार्वा भी वाणिज्यिक स्रोतों से आदेश दिया जा सकताहै 38,39 और उचित स्तर पर आहार या संयंत्र सामग्री पर पाला. ऐसे कई ऑनलाइन उपकरण भी हैं जो प्रत्येक इनस्टार40,41,42की पहचान करने में मदद कर सकते हैं . आहार पर पाले गए लार्वा में पौधों के विशिष्ट घटक नहीं होंगे, जैसे कि पौधों पर पले - बवे लार्वा द्वारा प्राप्त माइक्रोबियल सिम्बियोट . जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल परिवर्तित किया जा सकता है अगर इन घटकों को याद कर रहे हैं. लार्वा आंशिक रूप से या पूरी तरह से उनके मेजबान संयंत्र पर पाला जा सकता है अगर इन प्रभावों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं. प्रयोगों को खिलाने से कुछ घंटे पहले कीड़ों से भोजन को रोकना भी खिला व्यवहार में सुधार कर सकता है। क्षेत्र एकत्र लार्वा भी मजबूत और लाभप्रद हो सकता है क्योंकि उन्हें उचित ट्राफिक स्तर से अवगत कराया गया है, लेकिन यह एक अन्य चर जोड़ता है जो सभी अध्ययनों के लिए उपयुक्त हो सकता है या नहीं।

स्वस्थ, कीट और कीटनाशक मुक्त पौधों का उत्पादन भी महत्वपूर्ण है। वायरस, कीट कीट और कवक जीवों के साथ पौधों confounding कारकों का परिचय और reproduible डेटा प्राप्त करने में एक चुनौती पेश करेंगे.

कई लार्वा instars, आलू संयंत्र उम्र और पत्ती के आकार के अध्ययन के एक विशिष्ट प्रकार के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित करने के लिए जोड़ा जा सकता है. उपद्रव और फसल के समय की लंबाई भी समायोजित किया जा सकता है। संभावित रूप से, कई अन्य संयंत्र कीट बातचीत अलग पत्तियों का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है अगर पूरे संयंत्र टिप्पणियों एक आधार रेखा के रूप में उपयोग किया जाता है. अलग पत्ती परख जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए पूरे संयंत्र जड़ी बूटी अध्ययन के लिए एक प्रासंगिक और मूल्यवान विकल्प है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन में इस्तेमाल कीड़े प्रदान करने के लिए और लार्वा मचान में अपनी विशेषज्ञता के लिए बॉब Farrar और एलेक्सिस पार्क धन्यवाद करना चाहते हैं. पांडुलिपि की समीक्षा के लिए माइकल ब्लैकबर्न और Saikat घोष के लिए अतिरिक्त धन्यवाद.

इस प्रकाशन में व्यापार नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए पूरी तरह से है और अमेरिकी कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या समर्थन मतलब नहीं है.

USDA एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
agar substitute PhytoTechnology Laboratories G3251 product is Gelzan
containment vessel (6,12 or 24 well dish) Fisher Scientific  08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 many other companies sell these products
manduca eggs  Carolina Biological Supply Company 143880 30-50 eggs
manduca eggs  Great Lakes Hornworm NA 50, 100, 250 or 500 eggs
manduca larvae Carolina Biological Supply Company call for specific larval instar requests any instar
manduca larvae Great Lakes Hornworm call for specific larval instar requests any instar
microcentrifuge tubes, 1.7 ml  Thomas Scientific 1158R22 these have been tested in liquid N2 and will not explode
Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins PhytoTechnology Laboratories M519 used to make propagation medium
nutrient agar mix PhytoTechnology Laboratories M5825 product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan
paper filter discs Fisher Scientific  09-805A Whatman circles-purchase to fit in petri dish
petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm Fisher Scientific  FB0875713A or FB0875712 purchase size appropriate for leaf size
potato tubers  any B size (not organic) suggest Maine Farmer’s Exchange
pots, 10"  Griffin Greenhouse Supplies, Inc. 41PT1000CN2
preservative/biocide Plant Cell Technology NA product is PPM (Plant Preservative Mixture)
seed potatoes for explant source any B size (not organic) suggest Maine Farmer’s Exchange
slow release fertilizer (14-14-14 ) any NA Osmocote is a popular brand name
soft touch forceps BioQuip 4750
soil mix Griffin Greenhouse Supplies, Inc. 65-51121 product is Sunshine LC1 mix
sterile culture vessel  PhytoTechnology Laboratories C2100 Magenta-type vessel, PTL-100
sterile culture vessel  Fisher Scientific  ICN2672206 product is MP Biomedicals Plantcon

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पर्यावरण विज्ञान अंक 147 संक्रमण Manduca sexta Solanum tuberosum var. Kenbec herbivory C2H2 जस्ता उंगली प्रतिलेखन कारक रक्षा मार्ग जैस्मोनिक एसिड
Detached पत्ता परख चबाने कीट Manduca sexta द्वारा संक्रमण के दौरान आलू में जीन अभिव्यक्ति अध्ययन को सरल बनाने के लिए
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Novak, N. G., Perez, F. G., Jones,… More

Novak, N. G., Perez, F. G., Jones, R. W., Lawrence, S. D. Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta. J. Vis. Exp. (147), e59153, doi:10.3791/59153 (2019).

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