Summary
El método presentado crea tejido vegetal dañado herbívoro natural a través de la aplicación de larvas de Manduca sexta a hojas separadas de papa. El tejido vegetal se analiza para la expresión de seis homólogos del factor de transcripción implicados en las primeras respuestas al herbívoro de insectos.
Abstract
La naturaleza multitrófica de los estudios de expresión génica de herbívoros de insectos exige un gran número de réplicas biológicas, creando la necesidad de protocolos herbáricos más simples y simplificados. Las perturbaciones de los insectos masticadores generalmente se estudian en sistemas vegetales enteros. Si bien esta estrategia de todo el organismo es popular, no es necesario si observaciones similares se pueden replicar en una sola hoja separada. La suposición es que los elementos básicos necesarios para la transducción de la señal están presentes dentro de la propia hoja. En el caso de los primeros acontecimientos en la transducción de la señal, las células sólo necesitan recibir la señal de la perturbación y transmitir esa señal a las células vecinas que se ensayan para la expresión génica.
El método propuesto simplemente cambia el momento del desprendimiento. En experimentos con plantas enteras, las larvas se limitan a una sola hoja que finalmente se separa de la planta y se ensaya para la expresión génica. Si se invierte el orden de la escisión, desde el último en estudios de plantas enteras, hasta el primero en el estudio separado, se simplifica el experimento de alimentación.
Kennebec se propaga por transferencia nodal en un medio de cultivo de tejido simple y se transfiere al suelo para un mayor crecimiento si se desea. Las hojas se extircan de la planta madre y se trasladan a los platos de Petri donde el ensayo de alimentación se lleva a cabo con las etapas larvales de M. sexta. El tejido de la hoja dañado se ensaya para la expresión de eventos relativamente tempranos en la transducción de la señal. El análisis de la expresión génica identificó factores de transcripción Cys2-His2 (C2H2) específicos de la infestación, lo que confirma el éxito del uso de hojas desasociadas en estudios de respuesta temprana. El método es más fácil de realizar que las infestaciones de plantas enteras y utiliza menos espacio.
Introduction
Herbivory pone en marcha una serie de eventos moleculares durante los cuales una planta puede identificar el ataque y montar una respuesta apropiada para su supervivencia. Una planta recibe dos señales básicas de los insectos masticadores; uno por el daño físico al tejido y el otro a partir de sustancias específicas de insectos. Los patrones moleculares asociados al daño (DamP) se liberan en respuesta al daño creado por las partes bucales larvales y desencadenan una respuesta de herida bien definida que resulta en un aumento de la hormona ácido jasmónico y la transcripción de los genes de defensa1. Uno de los DamPs más conocidos es systemin, un polipéptido que se forma por el escote de la proteína prosystemin más grande después de que una hoja es herida2,3. La respuesta de la herida de ácido jasmónico se modula aún más por patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMPs), que pueden derivarse de saliva de oruga, contenido intestinal (regurgitante) y heces (frass)4. Los insectos utilizan estas sustancias para aumentar o evadir la respuesta de defensa5. Los factores de transcripción transmiten el mensaje de las señales hormonales en la respuesta de defensa a través de la regulación de los genes de defensa aguas abajo6,7,8.
Algunos estudios de interacción entre plantas y insectos utilizados en entornos de laboratorio son del tipo simulado, con el objetivo de aproximar el método natural de alimentación por el insecto. El herbívoro simulado generalmente se logra mediante la creación de daño artificial a los tejidos vegetales con varias herramientas que imitan el mecanismo específico de las partes bucales de insectos suficientes para causar la liberación de DAPP y desencadenar la producción de genes de defensa. Otros componentes específicos de insectos como las secreciones orales o regurgitante a menudo se añaden para replicar la contribución de los HAMPs9,10,11. La creación de un tamaño y tipo específico de herida y la aplicación de cantidades precisas de HAMPs es una ventaja para este tipo de estudios y puede ofrecer resultados más reproducibles. Los estudios herbívoros naturales, donde el daño al tejido vegetal se logra mediante la aplicación de insectos adquiridos en el campo o criados en laboratorio, a menudo son más difíciles porque el tamaño de la herida y las cantidades de HAMP se rigen por el comportamiento de los insectos y añaden variabilidad a la Datos. Los métodos naturales versus simulados y sus ventajas y desventajas están bien debatidas en la literatura12,13,14.
Para estudiar los primeros eventos de señalización, como los factores de transcripción, se debe consumir un cierto porcentaje de la hoja en un período relativamente corto de tiempo, por lo que las larvas deben comenzar a masticar inmediatamente y mantener el consumo hasta que la hoja se congele para su análisis. M. sexta es un alimentador voraz en múltiples plantas solanaceous durante muchas de sus etapas larvales, por lo que es ideal para impartir el máximo daño en un período relativamente corto de tiempo15. Esto es conveniente cuando se estudian los primeros eventos de señalización, ya que la respuesta de la planta ocurre casi inmediatamente después de que un insecto entra en contacto con la superficie de la hoja16,17. El método de contención de jaulas de clip comúnmente utilizado resulta torpe, ya que varias jaulas requerirían ajustes continuos a lo largo del experimento para permitir la eliminación o adición de larvas. Las hojas también deben ser lo suficientemente grandes y fuertes como para soportar la alimentación de múltiples insectos al mismo tiempo. Estos tipos de plantas de patata requieren una gran cantidad de espacio para observar la alimentación. Las larvas a menudo se reubican en la parte inferior de la superficie de la hoja, lo que también hace que las observaciones de alimentación sean bastante difíciles. El uso de plantas enteras para realizar estos experimentos es claramente engorroso.
El estudio actual utiliza hojas desprendidas aisladas en platos Petri en lugar de plantas enteras para agilizar y simplificar todo el enfoque vegetal para estudiar el herbívoro. La aplicación del protocolo en este estudio se limita a la observación de un grupo de factores de transcripción C2H2 inducidos temprano en las hojas de patata después del daño herbívoro por M. sexta larvas.
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Protocol
NOTA: El siguiente protocolo está diseñado para que una persona configure, haga observaciones y recoja muestras. Se pueden combinar varias ejecuciones de la misma configuración para aumentar la replicación biológica. Cualquier repetición adicional del experimento debe configurarse a la misma hora del día para eliminar posibles influencias diurnas en la expresión génica. El protocolo está diseñado para crear 3 hojas 'infestadas' para 5 puntos de tiempo de cosecha separados. Las hojas de control coincidentes para cada punto de tiempo crean un total de 30 muestras. El experimento se puede realizar con una variedad de tamaños de hojas y etapas larvales, pero se recomienda que el tamaño de la hoja, la etapa larval y el tiempo de infestación sean consistentes durante todo el procedimiento.
1. Preparación de las plantas de patata
NOTA: Todos los pasos que requieren técnica estéril deben realizarse en una campana de cultivo de tejido18,19.
- Prepare las plantas de Kennebec de la fuente explantada.
- Prepare el medio de propagación.
- Añadir 4,43 g de Murashige y Skoog (MS) con vitaminas en polvo, 20 g de sacarosa y 2 g de sustituto de agar a 1 L de agua purificada con ósmosis inversa (RO) en un matraz de 2 L con barra de espín. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando NaOH mientras continúa revolviendo.
NOTA: El agar no se disolverá hasta que se autoclave. - Añadir 1 ml de conservante/biocida y autoclave en ciclo líquido durante 20 min (121oC, 101,3 kPa). Retirar el medio del autoclave inmediatamente después de que el ciclo haya terminado y enfriarlo a 50 oC. Transfiera 100 ml de medio de propagación estéril y refrigerado a recipientes de cultivo estériles (por ejemplo, Magenta o Plantcon) utilizando una técnica estéril en una campana de cultivo de tejido.
- Añadir 4,43 g de Murashige y Skoog (MS) con vitaminas en polvo, 20 g de sacarosa y 2 g de sustituto de agar a 1 L de agua purificada con ósmosis inversa (RO) en un matraz de 2 L con barra de espín. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando NaOH mientras continúa revolviendo.
- Preparar el material de la explantación.
- Obtener fuente explantar como papas de semilla kennebec y eliminar todos los restos de tierra mediante el lavado con grifo H2O. Retire los brotes y cortar en trozos de 2 cm con un bisturí estéril.
- Esterilice las piezas del brote empapando durante 15 s en 70% de etanol, seguido de 13 min en 1:1 lejía (1 parte de RO-agua: 1 parte de lejía germicida/comercial concentrada). Enjuague 5 veces en H2O estéril.
- Transfiera el material explantativo a recipientes de cultivo de tejido estéril con medio de propagación en una campana de cultivo de tejido utilizando una técnica estéril. Transfiera los recipientes a una cámara de cultivo de tejido vegetal y crezca durante 2 a 2o123 semanas o hasta que se formen plantlets a 24oC, 16 h de luz (140 m-2os-1)/8 h fotoperiodo oscuro.
- Prepare el medio de propagación.
- Preparar plantas de papa sin tejido sintraidos.
- Prepare el medio de transferencia nodal.
NOTA: Esto hará 10 vasos de cultivo de tejido que pueden ser utilizados el mismo día o pueden ser hechos con anticipación y almacenados a 4 oC hasta la transferencia nodal.- Añadir 36,43 g de mezcla de agar nutritivo a 1 L de agua purificada por RO en un matraz de 2 L con una barra de centrifugado. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando KOH mientras continúa agitando.
NOTA: El agar no se disolverá hasta que se autoclave. - Autoclave en ciclo de líquido durante 20 min (121 oC, 101,3 kPa). Retirar el medio del autoclave inmediatamente después de que el ciclo haya terminado y enfriarlo a 50 oC. Transfiera 100 ml de recipientes de cultivo nodal refrigerados estériles a recipientes de cultivo estériles (ver la Tabla de Materiales)utilizando técnica estéril en una campana de cultivo de tejido.
- Añadir 36,43 g de mezcla de agar nutritivo a 1 L de agua purificada por RO en un matraz de 2 L con una barra de centrifugado. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando KOH mientras continúa agitando.
- Prepara esquejes nodal.
- Obtener los plantlets Kennebec cultivados a partir de material explantado (producido en el paso 1.1.2). Las plantlets deben tener al menos de 3 a 4 nodos (puntos de bifurcación). Retire las hojas con tijeras estériles o bisturí. Cortar las ramas cerca del tallo principal, dejando alrededor de 2 mm de tejido de rama.
- Retire las secciones nodal del tallo cortando aproximadamente 2 mm por encima y por debajo de cada punto de rama o nodo. Organizar esquejes nodales en un recipiente de cultivo de tejido estéril que contenga medio de transferencia nodal (producido en el paso 1.2.1.2) en la misma orientación que en el recipiente anterior (rama apuntando hacia arriba).
- Transfiera los recipientes con esquejes nodales a una cámara de cultivo de tejido vegetal y crezca durante 2 u20123 semanas a 24 oC, 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro.
NOTA: Cada corte nodal crecerá hasta convertirse en una nueva planta. El número de esquejes en cada recipiente determina el tamaño de la hoja. Menos esquejes transferidos por recipiente darán lugar a hojas más grandes. Tres plantas por recipiente tendrán hojas de 15 mm x 20 mm en 2 u20123 semanas.
- Prepare el medio de transferencia nodal.
- (Opcional) Preparar plantas de patata Kennebec cultivadas en el suelo.
NOTA: Para producir hojas más grandes, las plantas de papa sin extensión de nodal se pueden transferir al suelo.- Transfiera las plantas de patata cultivadas en el medio de transferencia nodal medio a tierra tirando suavemente de la planta del medio hasta que todo el tejido radicular se libere del agar.
- Transfiera al suelo justo por encima del 1o nodo de las raíces y empaque ligeramente el suelo alrededor del trasplante. Sube suavemente para asegurar el contacto del suelo con el sistema radicular.
- Colocar en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro y temperaturas diurnas/nocturnas de 25/20 oC.
NOTA: Las plantas están listas cuando las dos hojas completamente expandidas han alcanzado el tamaño adecuado para el ensayo.
- (Opcional) Preparar plantas de patata cultivadas con tubérculos.
NOTA: Las plantas de patata cultivadas a partir de tubérculos son más grandes y robustas y pueden ser útiles si se crían larvas en las plantas o si se desea alimentar la larvadurante durante la noche.- Coloque un tubérculo de patata 6 en profundidad en una olla de 10 en maceta que contenga mezcla de suelo complementada con fertilizante de liberación lenta de 10 ml de pellets.
- Colocar en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro y 25/20 oC de temperatura diurna/noche. Las plantas están listas aproximadamente a 30 o201240 días desde la plantación del tubérculo.
NOTA: No utilice plantas que hayan comenzado a florecer.
2. Preparación de insectos para la alimentación
- Obtener la etapa larval deseada de M. sexta.
NOTA: Las larvas para este estudio fueron criadas en dieta artificial hasta la 5a estrella20 y escenificadas por un individuo experimentado del insectiario interno. Las larvas también pueden criarse parcial o completamente en el tejido vegetal. Las larvas no comen inmediatamente antes de una muda y son más propensas a comer justo después de la muda, por lo que la puesta en escena adecuada es importante21. - Transfiera las larvas a un recipiente de contención apropiado (por ejemplo, plato de cultivo de tejido de 6, 12, 24 pozos) dependiendo del tamaño de la larva. Debe haber una larva por pozo en el plato.
NOTA: Las larvas pueden mostrar un comportamiento territorial o caníbal sin una fuente de alimento y pueden lesionarse si se alojan juntas. - (Opcional) Las larvas de hambre durante hasta 2 h, ya que esto puede mejorar la alimentación larvaria.
NOTA: Las larvas deben estar en un recipiente de contención almacenado en la cámara de crecimiento durante este tiempo.
3. Configuración de componentes para el experimento de infestación
NOTA: Consulte el resumen esquemático de la Figura1.
- Cree plantillas de ubicación para cada punto de tiempo de cosecha.
NOTA: Es útil configurar 5 bandejas diferentes para cada punto de tiempo de cosecha. Esto mantiene las muestras organizadas y permite que los platos se muevan de manera más eficiente como un conjunto sin cambiar su disposición. Si se realizan cálculos porcentuales de daño, esto es esencial, ya que las imágenes anteriores y posteriores a la infestación deben capturarse a la misma distancia focal.- Obtenga 5 bandejas robustas capaces de sostener un conjunto de seis platos Petri de tamaño adecuado y línea con papel blanco.
NOTA: El tamaño de la placa Petri se basa en el tamaño de hoja elegido para el ensayo de alimentación. La hoja debe caber fácilmente en el plato sin tocar los lados. Por ejemplo, un plato de 60 mm x 15 mm es adecuado para hojas de hasta 50 mm de longitud o anchura. - Trace un conjunto de seis círculos usando la placa Petri de tamaño adecuado en el papel en cada bandeja. Etiquete un conjunto de círculos 'control' A, B y C y el otro 'infestado' A, B y C. También etiquete cada plantilla de colocación con el tiempo de cosecha adecuado.
- Obtenga 5 bandejas robustas capaces de sostener un conjunto de seis platos Petri de tamaño adecuado y línea con papel blanco.
- (Opcional) Configure una cámara para la captura de imágenes "antes de la infestación" y "después de la infestación".
- Asegure una cámara en un soporte en la distancia focal adecuada para la captura de imágenes de todos los platos Petri en la plantilla de colocación.
- Etiquetar los tubos de punto de tiempo de cosecha.
- Etiquete un conjunto de tubos de microcentrífuga de 30, 1,7 ml correspondientes a cada círculo en la plantilla de colocación. Etiquetar los tubos para identificar adecuadamente la perturbación (control/infestado), la carta de replicación de la planta (A, B o C) y el punto de tiempo de cosecha (número de minutos después del período de infestación).
- Prepare los platos de Petri elegidos en el paso 3.1.1.
- Coloque un disco de papel de filtro estéril en cada uno de los 30 platos Petri del paso 3.1.1. Añadir agua estéril para humedecer los discos; no permita que el exceso de agua se acuse en el plato. Coloque cada plato en cada uno de los seis círculos en cada plantilla de colocación.
- Coloque tres plantas de papa junto a cada plantilla de colocación. Asegúrese de que las plantas tienen la misma edad y tamaño relativo.
4. Realizar infestación
NOTA: Se configura una plantilla de punto de tiempo de cosecha/ubicación a la vez.
- Retire las dos hojas superiores emparejadas de cada planta con tijeras estériles y coloque una hoja en la placa Petri de control y una en el plato Petri infestado para cada planta (A, B y C). Lleve a cabo este proceso lo más rápido posible.
- (Opcional) Transfiera la plantilla de colocación al soporte de la cámara para capturar una imagen de "antes de la infestación".
- Transfiera las larvas a cada plato infestado usando fórceps suaves al tacto tan rápido como sea posible. Ajuste el temporizador para el tiempo de 'infestación' deseado.
NOTA: El período de tiempo en que las larvas consumen el tejido de la hoja es el "tiempo de infestación". Esto es algo que se puede determinar empíricamente usando unas pocas hojas de prueba / larvas antes del inicio de la infestación real. El "tiempo de infestación" elegido debe ser consistente para todas las hojas infestadas.
NOTA: Las larvas deben ser manipuladas con cuidado por fórceps suaves. De 2a a 4a instar puede ser agarrado suavemente por su cuerno o sección media. - Observe la alimentación para asegurarse de que todas las larvas estén comiendo. Las larvas deben añadirse/eliminarse en función del comportamiento de alimentación. Mantenga las tapas de los platos de Petri tanto como sea posible.
NOTA: Se pueden utilizar varias larvas por hoja. - Retire las larvas de las hojas al final del tiempo de infestación. Inicie el temporizador para el tiempo de cosecha.
- (Opcional) Transfiera la plantilla de colocación al soporte de la cámara para capturar la imagen "después de la infestación".
NOTA: Las seis hojas en la plantilla de colocación se cosechan en el momento específico de la cosecha.
5. Cosecha de hojas
- Transfiera cada hoja al tubo etiquetado correspondiente al final de cada punto de tiempode cosecha y congele inmediatamente dejando caer el tubo en el líquido N 2. Almacenar el tejido vegetal cosechado a -80 oC hasta el aislamiento del ARN.
- Repita los pasos 4-u20125.1 para cada punto de tiempo de cosecha.
6. Procesamiento del tejido de la hoja para el análisis de la expresión génica
- Moler el tejido de la hoja congelada en un polvo con un micropsto.
- Aísle el ARN total y el proceso de expresión génica como se describió anteriormente22.
7. (Opcional) Estimación del daño de las hojas
- Calcule visualmente el porcentaje del daño de la hoja o calcule el área de la hoja en las imágenes antes y después de la infestación.
- Mida el área de la hoja con herramientas de software (por ejemplo, Fenofita)23.
- A partir de las mediciones del área de la hoja, calcule el porcentaje de daño como
% de daño [(área de la hoja antes – área de la hoja después)/área de la hoja antes] x 100.
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Representative Results
El consumo de hoja define el éxito del protocolo. Las larvas sanas y escenificadas con precisión deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la colocación en la superficie de la hoja y la alimentación debe continuar de manera bastante consistente durante el tiempo de infestación. En el video1, la larva en la parte superior comienza a masticar inmediatamente después de la colocación y mantiene una velocidad constante durante la alimentación. Esto es especialmente importante si se indica que los eventos tempranos de expresión génica después de la infestación. La larva en la parte inferior no consumió ningún material de hoja y es un ejemplo de una infestación infructuosa.
Las aproximaciones visuales durante el consumo de hojas se supervisan para garantizar que se produzcan suficientes daños. La cantidad de material de hoja consumido se puede calcular como el porcentaje de daño mediante el uso de imágenes de hojas antes y después de la infestación. La Figura 2 ilustra las tasas variables de consumo por diferentes etapas de desarrollo de larvas de M. sexta en diferentes tipos de plantas de patata. Las hojas de la Figura 2A se separaron de las plantas de cultivo de tejido sintraidos de 2 semanas de edad. Todas las hojas en esta figura son del mismo tamaño pero fueron sometidas a infestación por diferentes etapas de larvas durante 5 min. Figura 2A: I-IV, Video 2, Video 3, Video 4, y Video 5 ilustran las diferentes tasas de consumo y estilos de alimentación para cada etapa larval de una porción de la infestación. Esto es útil para determinar cuánto daño es posible utilizando cada combinación de hoja y etapa larval e ilustra la naturaleza voraz de las larvas más antiguas. No se recomienda el uso de larvas de 1a estrella, ya que sus mandíbulas no están lo suficientemente desarrolladas como para producir daños en la ventana de infestación de 5 minutos. Es importante tener en cuenta que las hojas más jóvenes más tiernas derivadas de plantas cultivadas en el cultivo de tejidos son a menudo más apetecibles para las larvas. En base a estos resultados, se eligieron larvas 4a estrella para evaluar aún más el daño a las hojas de plantas de papamás maduras cultivadas en el suelo. Las plantas cultivadas en el suelo se aproximan más a las adquiridas en el campo. La Figura 2B ilustra el rango de daño cuando se aplicaron larvas de 3a y 4a estrella a las hojas desprendidas de las plantas de papa cultivadas en el suelo. Las plantas propagadas por nodales de dos semanas de edad fueron trasplantadas al suelo y cultivadas durante 3 semanas más. Las hojas dañadas de las plantas cultivadas en el suelo cayeron en tres grupos; 15-20%, 20-30% y 30-40%. Se muestra que las tres hojas de cada grupo representan los diferentes niveles de daño para cada rango. Las hojas de plantas más maduras cultivadas en el suelo necesitaban más larvas aplicadas y un tiempo de infestación más largo para alcanzar el mismo nivel de daño observado en las hojas de plantas nodal más jóvenes. Estos resultados ilustran la gama de resultados posibles a partir del éxito herbívoro de diferentes tipos de plantas.
Después de que el herbívoro exitoso se completa y se evalúa el porcentaje de daño, el tejido de la hoja se ensayo para la expresión génica. Los resultados de la expresión génica deben indicar una inducción sólida o una represión de las transcripciones implicadas en la respuesta a la infestación. La Figura 3 ilustra los perfiles de expresión génica de seis factores de transcripción C2H2 de un exitoso experimento herbívoro en hojas separadas. C2H2 dedo de zinc StZFP2 fue inducido por M. sexta herbívoro en papa en estudios previos de plantas enteras24. Aunque StZFP2 fue inducido por el herbívoro en el ensayo de hojas separadas, la infestación no fue significativa en comparación con el efecto del propio desprendimiento. Sin embargo, otros dos homólogos StZFP2, StZFP5 y StZFP7,fueron inducidos significativamente a 40 y 80 min después del herbívoro en comparación con los controles separados. StLOX3 y StMYC2 son genes marcadores inducidos por heridas y herbívoros e indican la implicación de vías de defensa reguladas por ácido jasmónico. El objetivo de este estudio en particular fue identificar los factores de transcripción sensibles a la infestación entre un panel de genes candidatos. La identificación de dos factores de transcripción de dedos de zinc C2H2 que responden de manera robusta a M. sexta herivory apoya el uso de hojas separadas para ensayos de infestación.
Figura 1: Diagrama de flujo para el protocolo de infestación. Representación esquemática de los pasos incluidos en el flujo de trabajo experimental de la sección de infestación del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Daño en la hoja causado por larvas de M. sexta. (A) El daño porcentual a las hojas del cultivo de tejido en cada etapa larval más de 5 min. Los números romanos I-IV se refieren a videos 2-5 respectivamente que muestran cada estrella alimentándose de la hoja en la imagen. (B) Rango de daño a las hojas cultivadas en el suelo por 4a estrella más de 20 min. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de la expresión génica de las hojas. Se muestra el análisis de la expresión génica de la transcripción de los dedos de zinc C2H2 en tiempo real. El nivel medio de transcripción es de 2ct con (CT - CT del gen de la prueba - CT del gen de control exógeno). Las hojas de control con impuestos especiales en (azul) y las hojas infestadas con impuestos en (rojo) se muestran en cada punto de tiempo. Cada valor es el promedio de tres réplicas biológicas. El ANOVA de tres vías se llevó a cabo en los valores de la c.CT. Las diferencias significativas en las hojas de control a lo largo del tiempo se indican con mayúsculas. Las diferencias significativas en las hojas infestadas a lo largo del tiempo se indican en minúsculas. Las diferencias significativas entre el control y las hojas infestadas al mismo punto de tiempo se muestran con un asterisco (*). Los valores Pr > F fueron todos inferiores a 0,001, excepto para el tratamiento de control StZFP6 con 0,0086. Las barras de error representan la desviación estándar. Los números de adhesión de NCBI son: StLOX3-X96406.1, StZFP2- MK809525, StZFP4-CV500970.1, StZFP6-DN587601.1, StZFP7-DN590005.1. Los números de adhesión de Spud DB de
Vídeo 1: Videoclip de la alimentación larvario. Segunda instar M. sexta larvas alimentación (arriba) y no alimentación (abajo) en una hoja de dos semanas de edad cultivo de la planta de papa cultivada. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video 2: Figura 2A videoclip (I) de alimentación larvaria. Segunda instar M. sexta larva alimentándose de una hoja de dos semanas de edad cultivo de la planta de papa cultivada. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video 3: Figura 2A videoclip (II) de alimentación larvaria. Tercera instar M. sexta larva alimentándose de una hoja de dos semanas de edad cultivo de la planta de papa cultivada. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video 4: Figura 2A videoclip (III) de alimentación larvaria. Cuarta instar M. sexta larva alimentándose de una hoja de dos semanas de edad cultivo de la planta de papa cultivada. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Video 5: Figura 2A videoclip (IV) de alimentación larvaria. Quinta instar M. sexta larva alimentándose de una hoja de dos semanas de edad cultivo de la planta de papa cultivada. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
El uso de metodologías herbáceas de plantas enteras existentes no es necesario para lograr el objetivo de este estudio en particular (es decir, examinar un conjunto de genes candidatos para su respuesta a la infestación). El beneficio obvio del refinamiento de la hoja separada es acortar el tiempo que se tarda en realizar ensayos herbívoros. La naturaleza difícil de controlar de plantas enteras con jaulas de clip se elimina y los ensayos se realizan antes, ya que las plantas de tan solo 2 semanas se pueden utilizar para cosechar hojas. También requiere una huella mucho más pequeña durante la alimentación y menos espacio en la cámara de crecimiento; ambos son importantes cuando estos recursos son limitados.
La limitación de este ensayo, a saber, el desprendimiento, se encuentra cuando se ensayo la expresión del gen de defensa. El propio desprendimiento causa una respuesta de la herida y, por lo tanto, es importante evaluar qué efecto tiene el desprendimiento en los niveles basales de expresión del gen de defensa. En un estudio que involucró herbívoro simulado, los niveles de transcripción de un conocido inhibidor de la proteasa del gen de defensa II(PIN2) fueron inesperadamente altos en las hojas de control de las hojas de papa separadas probablemente debido a la "herida causada durante la recolección de la hoja" 25. Sin embargo, la aplicación de regurgitante de insectos de M. sexta mejoró en gran medida los niveles de expresión génica PIN2. Esto ilustra la necesidad de utilizar controles para burlarse del efecto del desprendimiento de la respuesta de infestación.
Los ensayos de hojas separadas a menudo se realizan para ahorrar tiempo, espacio y recursos. Se han utilizado en el cribado de resistencia a enfermedades fúngicas en trigo26,27,y resistencia a insectos en soja28 y garbanzo29. El ensayo es ampliamente aceptado en el estudio del patógeno que causa la plaga tardía en la patata30,31. Un estudio reciente encontró que los ensayos de hojas separadas eran equivalentes a ensayos de plantas enteras para determinar la resistencia tardía a la plaga en el campo32.
Sin embargo, existen escasas pruebas en la literatura para el uso de hojas separadas para el ensayo para la expresión de la defensa-gen. Un estudio perfiló seis genes de defensa en respuesta a la infestación de ácaros araña de frijol lima separado33. Las hojas también produjeron volátiles que indujeron respuestas de defensa en hojas cercanas no infestadas, una estrategia bien conocida de expresión de gen de defensa en las plantas34. Hasta nuestro conocimiento, hasta la fecha no se utilizan estudios herbívoros de insectos masticadores que utilizan hojas separadas para analizar la expresión génica.
El dedo de zinc C2H2 con capacidad de respuesta a la infestación previamente definido, StZFP2 no fue inducido significativamente por infestación en el ensayo de hoja desprendida actual. Aparte de la diferencia obvia de plantas enteras frente a hojas desprendidas, el estudio anterior utilizó un tipo continuo de infestación en la que se analizó el tejido vegetal para la expresión génica inmediatamente después de la eliminación de las larvas24. Esto es diferente del tipo discontinuo de infestación utilizado en el estudio actual, donde la eliminación de larvas fue seguida por un período de descanso antes de la cosecha de la hoja. Durante este período de recuperación, los niveles de StZFP2 disminuyen rápidamente y pueden resultar en un nivel más bajo de inducción de StZFP2. También podría haber otros componentes de señalización sistémica indefinidos hasta ahora que pueden contribuir a la inducción aumentada observada en todo el estudio de la planta. Otra posibilidad es que las transcripciones StZFP2 podrían haber alcanzado su punto máximo antes de los 20 minutos de cosecha. Está claro, sin embargo, que la impresionante inducción de las transcripciones StZFP5 y StZFP7 hacen que este tipo de protocolo de infestación sea relevante. Otra limitación del método actual sería la incapacidad de utilizar larvas de alimentación de raíces como la gusano de raíz de maíz. Tampoco sería adecuado cuando se está estudiando la comunicación de toda la planta, como la señalización de raíz a hoja35 o la señalización de las hojas sistémicas36,37.
El éxito de este protocolo depende en gran medida de la calidad y la correcta puesta en escena de la larva utilizada en el experimento. Las habilidades de crianza y los conocimientos básicos del comportamiento de M. sexta son útiles, pero no críticos. Sin embargo, la obtención de larvas sanas y adecuadamente escenificadas puede afectar directamente el éxito de la alimentación. Las larvas entran en un período de reposo que precede a cada muda larva durante la cual no se alimentan21. Claramente, estas larvas no dañarán el tejido de las hojas. El momento ideal para usar larvas es justo después de una muda. Una cohorte de insectos escenificado en el desarrollo de una etapa larvaria en particular también mejorará la reproducibilidad de la expresión génica, ya que las plantas pueden responder de manera diferente a cada etapa del desarrollo.
El acceso a un insectiario sería ideal para el suministro de larvas. Los huevos o larvas de M. sexta también pueden ser ordenados de fuentes comerciales38,39 y criados en dieta o material vegetal a la etapa apropiada. También hay varias herramientas en línea que pueden ayudar a identificar cada instar40,41,42. Las larvas criadas a dieta no contendrán componentes específicos de plantas como simbiontes microbianos adquiridos por larvas criadas en plantas43. Los perfiles de expresión génica pueden modificarse si faltan estos componentes. Las larvas pueden ser criadas parcial o completamente en su planta huésped si estos efectos son importantes para el estudio. La retención de alimentos de los insectos unas horas antes de los experimentos de alimentación también puede mejorar el comportamiento de alimentación. Las larvas recogidas en el campo también podrían ser robustas y ventajosas, ya que han estado expuestas a niveles tróficos adecuados, pero eso añade otra variable que puede o no ser adecuada para todos los estudios.
La producción de plantas sanas, libres de insectos y pesticidas también es fundamental. Las plantas con virus, plagas de insectos y organismos fúngicos introducirán factores de confunción y presentarán un desafío en la obtención de datos reproducibles.
Muchas estrellas larvales, las edades de las plantas de papa y los tamaños de las hojas se pueden combinar para personalizar el protocolo para un tipo específico de estudio. La duración de la infestación y los tiempos de cosecha también se pueden ajustar. Potencialmente, muchas otras interacciones entre plantas y insectos podrían estudiarse utilizando hojas desprendidas si se utilizan observaciones de plantas enteras como base. El ensayo de hojas separadas es una alternativa relevante y valiosa a los estudios herbívoros de plantas enteras para analizar la expresión génica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Bob Farrar y Alexis Park por proporcionar insectos utilizados en este estudio y por su experiencia en la puesta en escena larval. Gracias adicionales a Michael Blackburn y Saikat Ghosh por la revisión crítica del manuscrito.
La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
USDA es un Proveedor y Empleador de Igualdad de Oportunidades.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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