MicroFocus X-ray CT (microCT) Imaging af Actinia equina (CNIDARIA), Harmothoe Sp. (Annelida), og xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)
Summary
Her forklares i detaljer protokoller til udførelse af MicroFocus X-ray computertomografi (microCT) Imaging af tre Marine hvirvelløse dyr. Denne undersøgelse beskriver trin som prøve fiksering, farvning, montage, scanning, billed rekonstruktion og dataanalyser. Der gives også forslag til, hvordan protokollen kan justeres for forskellige prøver.
Abstract
Traditionelt har biologer måttet forlade sig på destruktive metoder såsom skæring for at undersøge de interne strukturer af uigennemsigtige organismer. Ikke-destruktiv MicroFocus X-ray computertomografi (microCT) Imaging er blevet en kraftfuld og fremspirende protokol i biologi, på grund af teknologiske fremskridt i prøve farvning metoder og innovationer i microCT hardware, behandling af computere, og data Analysis software. Men denne protokol er ikke almindeligt anvendt, som det er på det medicinske og industrielle områder. En af årsagerne til denne begrænsede brug er manglen på en enkel og forståelig manual, der dækker alle de nødvendige skridt: prøveindsamling, fiksering, farvning, monteringen, scanning, og dataanalyser. En anden grund er den store mangfoldighed af metazoanere, især Marine hvirvelløse dyr. På grund af hvirvelløse vanddyr ‘ forskelligartede størrelser, morfologier og fysiologier er det afgørende at justere eksperimentelle forhold og hardwarekonfigurationer på hvert trin, afhængigt af prøven. Her forklares Mikroct-billedbehandlings metoder i detaljer ved hjælp af tre Fylogenetisk mangfoldige Marine hvirvelløse dyr: Actinia equina (anthozoa, CNIDARIA), Harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida) og xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Forslag til udførelse microCT Imaging på forskellige dyr er også forudsat.
Introduction
Biologiske forskere generelt har måttet gøre tynde sektioner og udføre observationer af lys eller elektronmikroskopi for at undersøge de interne strukturer af uigennemsigtige organismer. Disse metoder er imidlertid destruktive og problematiske, når de anvendes på sjældne eller værdifulde prøver. Desuden er flere trin i metoden, såsom indlejring og skæring, tidskrævende, og det kan tage flere dage at observere en prøve, afhængigt af protokollen. Desuden, ved håndtering af talrige sektioner, er der altid en mulighed for at beskadige eller miste nogle sektioner. Vævs clearing teknikker er tilgængelige for nogle enheder1,2,3,4,5 , men er endnu ikke gældende for mange dyrearter.
For at overvinde disse problemer, nogle biologer er begyndt at bruge MicroFocus X-ray computertomografi (microct) billeddannelse6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. I røntgen CT er præparatet bestrålet med røntgenstråler fra forskellige vinkler, der genereres fra en røntgenstråle kilde, som bevæger sig rundt i prøven, og de transmitterede røntgenstråler overvåges af en detektor, der også bevæger sig rundt i prøven. De opnåede røntgen transmissions data analyseres for at rekonstruere tværsnitsbilleder af præparatet. Denne metode gør det muligt at observere interne strukturer uden at ødelægge prøven. På grund af sin sikkerhed og lethed, det er almindeligt anvendt i medicinsk og dental applikationer, og CT-systemer kan findes i hospitaler og dental centre i hele verden. Desuden anvendes industrielt røntgen-CT hyppigt til observation af ikke-medicinske prøver til inspektion og metrologi på industriområdet. I modsætning til medicinsk CT, hvor røntgen kilden og detektorerne er mobile, er de to dele fastgjort i industriel CT, hvor prøven roterer under scanningen. Industriel CT generelt producerer højere opløsning billeder end medicinsk CT og omtales som microCT (micrometer-level resolution) eller nanoCT (nanometer-niveau opløsning). For nylig, forskning ved hjælp af microct er hurtigt steget inden for forskellige områder af biologi14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Biologiske undersøgelser ved hjælp af CT oprindeligt målrettede interne strukturer, der hovedsagelig består af hårdt væv, såsom knogle. Fremskridt i farvningsteknikker ved hjælp af forskellige kemiske agenser muliggjorde visualisering af blødt væv i forskellige organismer6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. af disse reagenser er jod-baserede kontrastmidler relativt sikre, billige og kan anvendes til visualisering af blødt væv i forskellige organismer7,14. Med hensyn til hvirvelløse Marine dyr er microct i vid udstrækning blevet anvendt på sådanne dyr som bløddyr6,25,32,33, Ledorme18,19, 20 , 28, og arthoropods21,23,29,31. Der har dog været få rapporter om andre animalske phyla, såsom bryozoans6, xenacoelomorphs26, og cnidarians24,30. Generelt har der været færre studier med Mikroct på hvirvelløse havdyr end på hvirveldyr. En væsentlig årsag til denne begrænsede brug af hvirvelløse havdyr er den store diversitet, der observeres i disse dyr. På grund af deres forskelligartede størrelser, morfologier og fysiologier, reagerer hver art forskelligt på forskellige eksperimentelle procedurer. Det er derfor afgørende under prøveforberedelsen at vælge det mest hensigtsmæssige fikserings-og farvnings reagens og at fastsætte betingelser for hvert trin, justeret for hver art. På samme måde er det også nødvendigt at indstille scannings konfigurationerne, såsom monteringsmetode, spænding, aktuel, mekanisk forstørrelsesgrad og rumopløsnings kraften, passende for hver prøve. For at løse dette problem, en enkel og forståelig manual, der dækker alle de nødvendige skridt, forklarer, hvordan hvert trin kan justeres afhængigt af prøven, og viser detaljerede eksempler fra flere prøver er afgørende.
I denne undersøgelse beskriver vi Mikroct Imaging Protocol trin-for-trin, fra prøve fiksering til dataanalyse, ved hjælp af tre Marine hvirvelløse arter. Prøver af havanemone Actinia equina (anthozoa, CNIDARIA) blev indsamlet i nærheden af Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo. De havde en sfærisk, blød krop, der var omkring 2 cm i diameter (figur 1a-C). Harmothoe Sp. (polychaeta, Annelida) prøver blev også indsamlet i nærheden af Misaki Marine Biological Station. De var slanke orme, der var omkring 1,5 cm i længden, med hårde chaetae til stede langs hele kroppen (figur 1d). En Xenoturbella japonica35 (xenoturbellida, Xenacoelomorpha) prøveeksemplar blev samlet i nærheden af Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, under den 13. Det var en soft-bodied orm, der var omkring 0,8 cm i længden (figur 1E). Justeringer for de enkelte prøvens betingelser og konfigurationer forklares i detaljer. Vores undersøgelse giver flere forslag til, hvordan man udfører microCT Imaging på marine invertebrater, og vi håber, at det vil inspirere biologer til at udnytte denne protokol til deres forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fikater, der anvender formalin, såsom 10% (v/v) formalin-opløsningen i havvand, som anvendes i dette studie, er kendt for at bevare morfologien af forskellige Marine hvirvelløse dyr og anvendes ofte til mikroct-billeddannelse18,24,25 ,26,28,30,33. Begrænsningerne i anvendelsen af dette …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Toshihiko Shiroishi for hans hjælp og for at tilvejebringe forskningsmiljøet under denne undersøgelse. Vi er taknemmelige for Kensuke Yanagi og Takato Izumi for rådgivning om a. equinaog Masaatsu Tanaka til rådgivning om Harmothoe Sp.-prøven. Vi vil gerne takke personalet på Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba og Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo for deres hjælp i prøve samlinger. Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk sprog redigering. Dette arbejde blev støttet af JSPS-støtten til unge videnskabsmænd (A) (JP26711022) til HN og JAMBIO, den japanske forening for havbiologi.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
